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病毒学报 2011年第4期27卷 353-357页

作者：孙美玉秦立廷高玉龙祁小乐高宏雷王永强王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白。首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞... 详细信息

本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白。首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞,使σC基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidσC。通过脂质体介导将其转染到sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rBacσC。通过Western Blot、间接免疫荧光试验(IFA)进行检测,结果显示:σC蛋白在重组杆状病毒rBacσC感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达,分子质量约为37kD,表达的σC蛋白具有良好的反应活性。

关键词：禽呼肠孤病毒 σC基因 sf9细胞杆状病毒

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猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染对仔猪致病性的评估

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中国预防兽医学报 2007年第5期29卷 336-340,393页

作者：温永俊吴国军蔡雪辉刘永刚王洪峰姜成刚尹训南中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

本研究通过猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)强毒共感染3周龄健康仔猪来评价其致病性。试验动物随机分为3组,空白对照组(n=3头),PRRSV单独感染组(n=3头),PCV2和PRRSV共感染组(n=6头),从而比较相互之间的差异。通过临床症状、病理学变化、病原学和血清学检查,对二者混合感染仔猪的致病性进行了研究。结果表明PCV2和PRRSV共同感染能引起仔猪断奶后多系统消耗性综合征,表现为淋巴组织肿大、出血,肉芽肿性炎症,坏死性肝炎,仔猪消瘦、生长缓慢等特征性病变;混合感染能加重PRRSV对仔猪引起的间质性肺炎的严重程度。混合感染可以出现支气管肺炎和明显的肝病变,淋巴结多呈界限明显的块状出血等典型病变。

关键词：猪圆环病毒2型猪繁殖与呼吸综合征混合感染致病性

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猪输血传播病毒(TTV)与猪圆环病毒混合感染的检测及TTV遗传变异分析

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中国预防兽医学报 2011年第1期33卷 6-10页

作者：刘建波郭龙军危艳武黄立平吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室哈尔滨150001

为了解我国猪群中猪输血传播病毒(TTV)与猪圆环病毒(PCV)混合感染情况,本研究采用PCR方法对采自14个省280份病料样品进行检测,结果显示,TTV1和TTV2阳性检出率分别为51.8%和28.2%,TTV1与TTV2混合感染率为18.2%;PCV1和PCV2阳性率分别为41... 详细信息

为了解我国猪群中猪输血传播病毒(TTV)与猪圆环病毒(PCV)混合感染情况,本研究采用PCR方法对采自14个省280份病料样品进行检测,结果显示,TTV1和TTV2阳性检出率分别为51.8%和28.2%,TTV1与TTV2混合感染率为18.2%;PCV1和PCV2阳性率分别为41.1%和37.5%,PCV1与PCV2混合感染率为19.6%;PCV2阳性样品中TTV1和TTV2混合感染率达75.0%。此外,对2株TTV1基因组进行测序,与GenBank中登录的6个TTV1序列比对,相似性结果为67.3%～95.1%;对4株TTV2基因组测序,与GenBank登录的4条TTV2序列比对,相似性为84.7%～90.4%;将TTV1与TTV2进行序列比对,相似性仅为44.0%。TTV1和TTV2基因高变区分别位于520 nt～2 594 nt和720 nt～2 170 nt;TTV1基因保守区位于1 nt～520 nt和2 595 nt～2 800 nt;而TTV2基因保守区位于1 nt～719 nt和2 171 nt～2 800 nt。以上结果表明,我国猪群中存在TTV与PCV2的混合感染,并且两种病毒混合感染引起的相关疾病可能存在协同致病性;TTV1和TTV2基因型差异较大,具有遗传变异多样性的特点。

关键词：猪输血传播病毒猪圆环病毒混合感染遗传变异分析

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR变异株第125代的毒力试验

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中国兽医科学 2011年第2期41卷 152-158页

作者：危艳武刘长明范培虎吴洪丽温士刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/... 详细信息

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/mL)经肌肉注射和滴鼻途径接种18头35日龄PRRSV抗体阴性猪,同时设未接种对照组。结果试验猪未出现明显的临床症状。用RT-PCR法检测试验猪血清,从第3天开始出现阳性,第7～14天达到高峰,第28天后转为阴性。对同一时间迫杀的试验猪检测各脏器组织中的病毒抗原分布情况,结果表明,感染后第7～14天试验猪多数脏器呈阳性反应,第21～42天病毒集中在脾、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结等组织。病理学观察发现,第7～14天试验猪淋巴结及肺出现轻度病变。动物感染试验表明,尽管试验猪未显示明显的临床症状,但从病毒血症、病毒体内分布、病理变化等方面看,该毒株仍然具有一定的毒力,用于弱毒疫苗的研制还有待进一步驯化致弱。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株细胞传代毒力试验

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猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1R株致弱过程中ORF5基因遗传变异分析

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中国预防兽医学报 2007年第9期29卷 665-670页

作者：吴国军蔡雪辉刘永刚王洪峰王淑杰石文达马平张琪李成君中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株在Marc-145细胞上传代,用85代(S85)病毒对35日龄的仔猪进行人工感染试验,证实该毒株已经被致弱,将其命名为CH-1R株。利用RT-PCR扩增10个不同代次的CH-1a株和CH-1R株病毒的ORF5基因,并与9株参考毒株进行R... 详细信息

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株在Marc-145细胞上传代,用85代(S85)病毒对35日龄的仔猪进行人工感染试验,证实该毒株已经被致弱,将其命名为CH-1R株。利用RT-PCR扩增10个不同代次的CH-1a株和CH-1R株病毒的ORF5基因,并与9株参考毒株进行RFLP分析,发现了一个特异性的内切酶酶切位点-TspEⅠ。根据该酶切位点,可以区分CH-1R株、CH-1a株、其它野生型毒株和参考毒株。ORF5基因的变异分析显示,该致弱毒株与CH-1a株以及其它8株参考毒株存在着差异,并且它们的氨基酸同源性在88.5%～97.0%之间。系统进化树研究表明该弱毒株仍属于CH-1a亚支。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 CH—1R株 ORF5 变异分析

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

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中国预防兽医学报 2007年第9期29卷 704-709页

作者：郝晓芳周艳君田志军韦天超安同庆彭金美华荣虹童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

2006年5月以来,我国部分猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory ... 详细信息

2006年5月以来,我国部分猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的。本实验参考GenBank发表的以及本实验室分离鉴定的PRRSV的nsp2基因序列,在nsp2缺失区的两端的保守区设计并合成了一对引物,建立了一种PRRSV的RT-PCR检测方法。该方法扩增高致病性PRRSV基因组时可获得230bp的片段,扩增经典型PRRSV时则获得320bp的片段,根据RT-PCR产物大小可将二者区分开来。通过大量临床病料的检测,并配合PCR产物测序验证,结果表明该方法简便、快速、特异,可以鉴别高致病性PRRSV,为进一步的PRRS流行病学研究提供了重要的技术手段。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因缺失 RT-PCR 鉴别诊断

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猪繁殖与呼吸综合征病毒GD3株的分离鉴定及其分子特征

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中国预防兽医学报 2009年第1期31卷 28-33页

作者：马平蔡雪辉刘永刚石文达王淑杰王洪峰李成君张琪中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

2005年从广东发病猪场采集的猪繁殖与呼吸综合征疑似病料中,分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),命名为GD3株。采用RT-PCR、IFA对分离毒株进行鉴定,并在Marc-145细胞上完成了病毒的增殖和理化性质的鉴定。应用RT-PCR方法扩增出GD3... 详细信息

2005年从广东发病猪场采集的猪繁殖与呼吸综合征疑似病料中,分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),命名为GD3株。采用RT-PCR、IFA对分离毒株进行鉴定,并在Marc-145细胞上完成了病毒的增殖和理化性质的鉴定。应用RT-PCR方法扩增出GD3株的6条基因大片段,扩增产物克隆于pMD18-T载体鉴定后测序,同时应用RACE技术对GD3株的5'末端进行扩增和测序。结果表明GD3株基因组全长15425nt,包含个9开放阅读框,5'UTR长189nt,3'UTR长150nt。序列分析结果表明,GD3株在分子遗传演化上介于PRRSV变异毒株(HuN4株、JXA1株)和CH-1a之间,与HuN4和JXA1之间的相似性为97.1%和97.2%;与CH-1a的核苷酸相似性为94.9%。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定

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猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2009年第9期39卷 779-785页

作者：黄立平刘长明危艳武陆月华郭龙军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法。用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%... 详细信息

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法。用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%,且与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应。该阻断ELISA与血清中和试验的检测结果呈显著正相关(r=0.997 0),其敏感性还优于血清中和试验。用阻断ELISA对PCV2灭活疫苗免疫与攻毒试验猪血清样品进行检测,结果显示,疫苗接种后第2周就能检测到PCV2中和抗体,4周后阳转率达100%。另外,用该方法对东北三省不同地区送检的703份血清样品进行检测,结果阳性检出率为73.0%。表明,东北三省猪场中的PCV2感染率较高,危害严重。

关键词：猪圆环病毒2型中和抗体单克隆抗体阻断ELISA

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猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5和ORF6在真核细胞中表达

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中国预防兽医学报 2007年第7期29卷 501-505,514页

作者：闫丽萍周艳君侯艳红华荣虹安同庆童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

用PCR方法从重组质粒pOKCH-1a扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5、ORF6,将它们分别定向克隆到含有鸡β-actin启动子的高效真核表达载体pCAGGS的多克隆位点,经酶切、PCR及测序分析,筛选鉴定出含有ORF3、ORF5、ORF6基... 详细信息

用PCR方法从重组质粒pOKCH-1a扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5、ORF6,将它们分别定向克隆到含有鸡β-actin启动子的高效真核表达载体pCAGGS的多克隆位点,经酶切、PCR及测序分析,筛选鉴定出含有ORF3、ORF5、ORF6基因的重组质粒,分别命名为pCAGGS-ORF3、pCAGGS- ORF5、DCAGGS-ORF6。将重组质粒纯化后转染293T细胞,用RT-PCR扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光检测,结果在胞浆内有亮绿色荧光,而在细胞膜上没有见到荧光,这说明表达的蛋白在胞浆内而不在细胞膜上。通过Westerm blot检测确定表达的GP3、GP5和M蛋白的分子量分别为42 Ku、25 Ku和19 Ku。本试验结果为进一步研究PRRSV膜蛋白伪病毒粒子及DNA疫苗奠定了基础。

关键词：繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因真核表达

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与猪圆环病毒2型基因组茎环结构相互作用的宿主细胞蛋白的筛选

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中国兽医科学 2013年第12期43卷 1211-1216页

作者：张辉唐青海危艳武黄立平张志慧刘建波吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库... 详细信息

利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库,将总cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化酵母诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建,以药物筛选阳性克隆;通过酵母菌落PCR得到阳性克隆中的cDNA插入片段,通过序列分析对此予以确认。本试验成功地构建了酵母单杂交文库,筛选出1.01×106个酵母克隆,其中196个为阳性克隆。经PCR产物测序,并通过NCBI Blast法进行序列比对,确定有4种蛋白可与PCV2基因组茎环序列发生作用。本研究从宿主细胞cDNA文库中筛选到4种可与PCV2基因组茎环序列发生作用的蛋白,为下一步阐明这些宿主蛋白对PCV2复制的调节作用奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型茎环结构宿主细胞互作蛋白

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