检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医学报 2023年第11期43卷 2293-2297页

作者：李志杰刘培欣杨涛张瑜宋海慧张闯王岳中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为探索猪血小板反应蛋白3(thrombospondin 3,THBS3)在PRV复制中的功能,利用CRISPR/Cas9系统构建THBS3基因缺失的PK-15稳定细胞株。首先,根据THBS3基因序列和CRISPR/Cas9靶点设计原则设计并合成2对sgRNA序列,退火后连接到Lenti-CRISPRv2慢病毒表达载体;与慢病毒包装质粒共转染人胚肾细胞(HEK293T)获得重组慢病毒,收集细胞上清并离心去细胞碎片后转导PK-15细胞,进行嘌呤霉素筛选获得THBS3敲除的PK-15细胞株;将重组病毒rPRV-GFP接种至野生型和缺失型细胞评价病毒复制差异。结果显示,表达sgRNA的重组质粒构建成功;将收获的慢病毒转导细胞后通过筛选获得1株无THBS3蛋白表达细胞株(PK-THBS3-KO),通过测序发现外显子3有1个碱基的插入;感染试验显示,THBS3基因缺失后抑制了PRV复制。结果表明,通过CRISPR/Cas9系统成功构建了PK-15的THBS3基因敲除的稳定细胞株,PRV感染试验显示基因缺失后抑制了病毒复制。

关键词： THBS3 PK-15细胞 CRISPR/Cas9 PRV

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一株猫疱疹病毒Ⅰ型的分离与鉴定

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畜牧兽医学报 2023年第4期54卷 1713-1720页

作者：许鑫燕郑亚婷刘迪马波刘家森曲连东东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

采集哈尔滨某猫舍中表现为上呼吸道感染的患病猫眼、鼻拭子,PCR初步确诊为猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒(FHV-1)混合感染。利用猫肾细胞(CRFK)对样本进行病毒分离,前两代细胞培养物的核酸检测结果为FHV-1和FCV阳性,第三代开始只有FCV阳性... 详细信息

采集哈尔滨某猫舍中表现为上呼吸道感染的患病猫眼、鼻拭子,PCR初步确诊为猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒(FHV-1)混合感染。利用猫肾细胞(CRFK)对样本进行病毒分离,前两代细胞培养物的核酸检测结果为FHV-1和FCV阳性,第三代开始只有FCV阳性,由此分离出FCV。制备此株FCV的鼠源多克隆抗体,并中和混合培养物中的FCV,从而分离出FHV-1,命名为HRB2019株。通过病毒粒子形态观察、间接免疫荧光试验(IFA)和基因序列分析等方法鉴定HRB2019株,并研究其体外生长动力学。结果显示,HRB2019株可在CRFK细胞上产生典型病变,测得其第四代病毒滴度为1×10^(8.43) TCID 50·mL^(-1);电镜下可观察到球形、有囊膜、直径约为200 nm的病毒粒子;IFA结果显示,分离株可与FHV-1阳性血清结合,出现特异性荧光;扩增分离株的gD基因,其与国内外流行株高度同源。病毒一步生长曲线表明,HRB2019株感染细胞12 h后开始复制增殖,12~36 h为快速增殖期,48~72 h进入增殖平台期且滴度达到高峰,84 h病毒滴度开始下降。本研究首次从FCV与FHV-1混合感染的病料中成功分离出FHV-1,为FHV-1的流行病学调查和病原学研究提供了重要数据,为混合感染中生长弱势毒株的分离提供了方法学依据。

关键词：猫疱疹病毒猫杯状病毒分离鉴定

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非洲猪瘟病毒研究进展:组学视角

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病毒学报 2022年第1期38卷 246-256页

作者：潘力罗瑞王涛罗玉子孙元仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种致死率可高达100%的猪烈性传染病。ASF的传播方式复杂多样,目前无商品化疫苗可用,仅能依靠检疫结合扑杀进行防控,严重威胁全球养猪及相... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种致死率可高达100%的猪烈性传染病。ASF的传播方式复杂多样,目前无商品化疫苗可用,仅能依靠检疫结合扑杀进行防控,严重威胁全球养猪及相关行业的健康发展。阻碍ASF疫苗研发的主要因素是ASFV的基因型众多、结构复杂,以及对ASFV致病和免疫逃逸机制的认识不足。本文从基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等层面多角度综述ASFV的生物学特性及其致病和免疫逃逸机制,以期揭开ASF这个"杀手"的神秘面纱,为ASFV的致病机制研究和ASF的防控提供参考。

关键词：非洲猪瘟病毒基因组学转录组学蛋白质组学代谢组学

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不同毒力传染性支气管炎病毒诱导SPF鸡炎症反应的免疫机制

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东北农业大学学报 2023年第1期54卷 60-69页

作者：马得莹范佳慧任梦婷谢晶晶王芳芳焦亚茹韩宗玺东北农业大学动物科学技术学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

以specific pathogen-free(SPF)鸡为研究对象,通过滴鼻点眼方式感染传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)强毒株(CK/CH/LDL/140520)和IBV弱毒株(γCoV/ck/China/I0718/17)。分别在感染后12、36 h和3、7、14 d,采集法氏囊、脾脏、肾脏和气管,运用实时荧光定量PCR法,检测感染不同毒力IBV后,SPF鸡各脏器组织中免疫相关因子表达差异,初步探讨SPF鸡对不同毒力IBV免疫反应机制。结果表明,IBV弱毒株感染早期主要上调Toll样受体15(Toll-like receptors 15,TLR15)基因表达水平,提高白细胞介素(Interleukin,IL-1β)、IL-8基因表达量。法氏囊是介导启动获得性免疫反应的主要器官;脾脏是介导调控获得性免疫反应的主要器官,IBV强毒株在感染后期持续诱导提高TLR7、TLR15、TLR21基因和IL-6基因表达水平。可知,不同毒力IBV诱导SPF鸡炎症反应的免疫活化机制及介导调控获得性免疫反应的器官存在一定差异,为进一步揭示IBV强弱毒株致病性差异及诱导宿主不同免疫反应激活机理提供新的参考依据。

关键词：传染性支气管炎病毒 SPF鸡 Toll样受体细胞因子

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抗丝状支原体丝状亚种单克隆抗体的制备及初步应用

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畜牧兽医学报 2022年第7期53卷 2290-2299页

作者：曾金红徐青元沙玮萍吴爽李媛辛九庆王秀梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

旨在制备抗丝状支原体丝状亚种(Mmm)的特异性单克隆抗体(MAb),为牛传染性胸膜肺炎(CBPP)病原诊断的免疫学方法提供特异性抗体。本研究利用生物信息学技术分析了Mmm国内分离株Ben-1不同传代株的全基因组序列,选取M0071蛋白作为研究对象... 详细信息

旨在制备抗丝状支原体丝状亚种(Mmm)的特异性单克隆抗体(MAb),为牛传染性胸膜肺炎(CBPP)病原诊断的免疫学方法提供特异性抗体。本研究利用生物信息学技术分析了Mmm国内分离株Ben-1不同传代株的全基因组序列,选取M0071蛋白作为研究对象。将原核表达的可溶性重组蛋白M0071(rM0071)作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过有限稀释法和间接ELISA方法筛选得到能稳定分泌抗rM0071蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。进一步制备单抗腹水并纯化,利用Western blot方法对该单抗进行特异性鉴定,同时测定其抗体效价和抗体亚类。随后利用间接免疫荧光试验(IFA)评价该单抗对细胞感染Mmm的检测能力。结果表明成功获得1株单克隆细胞株3C4A1,将其分泌抗体命名为MAb 3C4A1。特异性结果表明,MAb 3C4A1能与Mmm的分离株和标准株发生特异性反应,而不与山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、牛鼻支原体、无乳支原体、牛支原体、leachii支原体和牛A型巴氏杆菌等发生反应。抗体亚类鉴定MAb 3C4A1属于IgG1亚类、轻链为κ链。经间接ELISA测定其抗体效价为1∶256000。IFA试验结果表明,MAb 3C4A1仅与感染EBL细胞的Mmm发生绿色荧光反应,而与牛鼻支原体、无乳支原体、牛支原体感染的细胞不发生荧光反应,特异性良好。本研究制备的MAb 3C4A1具有良好的特异性和免疫反应性,可作为CBPP病原免疫学诊断的工具,为进一步研制CBPP病原鉴别诊断试剂盒提供了基础材料。

关键词：丝状支原体丝状亚种 M0071蛋白单克隆抗体间接免疫荧光检测

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猪繁殖与呼吸综合征病毒凝胶层析纯化方法的建立与初步应用

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中国兽医杂志 2023年第4期59卷 1-6页

作者：孙悦王尚辉涂亚斌杨勇博王洪峰夏大松蔡雪辉安同庆孙明霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 哈尔滨维科生物技术有限公司黑龙江哈尔滨150069

为了高效分离纯化并获得结构完整的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),用于PRRSV的形态学研究、动物免疫以及制备高质量疫苗,本试验在Marc-145细胞中增殖PRRSV HuN4株,经超滤浓缩后,分别采用氯化铯密度梯度离心方法和凝胶层析技术纯化PRRS... 详细信息

为了高效分离纯化并获得结构完整的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),用于PRRSV的形态学研究、动物免疫以及制备高质量疫苗,本试验在Marc-145细胞中增殖PRRSV HuN4株,经超滤浓缩后,分别采用氯化铯密度梯度离心方法和凝胶层析技术纯化PRRSV。结果显示,与氯化铯密度梯度离心相比,凝胶层析纯化可以得到纯度更高、结构更完整的病毒粒子。将凝胶层析纯化得到的PRRSV免疫小鼠制备多抗,间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,多抗血清可与PRRSV发生特异性反应;酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示,抗体效价可达到1∶25600以上,纯化的病毒具有良好的免疫原性。结果表明,应用凝胶层析技术可得到高纯度、结构完整的PRRSV粒子,且纯化后PRRSV能够诱导良好的免疫应答,本试验结果可为PRRSV的纯化提供参考。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒凝胶层析技术纯化形态学

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DBNL蛋白影响A型流感病毒复制机制的研究

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中国预防兽医学报 2023年第11期45卷 1095-1100页

作者：孟德锦李奇兵胡玉珍王一涵王波石文军单智博姜丽陈化兰李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

A型流感病毒(IAV)在宿主细胞内复制过程中需要许多宿主因子的参与,同时IAV也能调控多种宿主因子的表达。为寻找调控IAV复制的宿主因子,本研究通过SDS-PAGE电泳检测发现H1N1亚型流感病毒A/WSN/1933株(简写为WSN)感染A549细胞会上调表达55... 详细信息

A型流感病毒(IAV)在宿主细胞内复制过程中需要许多宿主因子的参与,同时IAV也能调控多种宿主因子的表达。为寻找调控IAV复制的宿主因子,本研究通过SDS-PAGE电泳检测发现H1N1亚型流感病毒A/WSN/1933株(简写为WSN)感染A549细胞会上调表达55 ku左右的特异蛋白条带(感染后9 h),将该55 ku左右的蛋白条带切胶回收后进行质谱分析,根据质谱分析的筛选标准选择蛋白得分(Mass score)较高、谱图数(Matches)和序列数(Sequences)较为可信的宿主因子DBNL作为调控IAV复制的潜在研究对象进一步研究。本研究针对DBNL设计特异的siRNA和对照Scrambled siRNA,将其分别转染A549细胞,通过荧光定量PCR确定DBNL siRNA在转录水平的干扰效果显著;利用细胞活力测定试验确定DBNL siRNA的干扰不影响细胞活力。利用DBNL siRNA下调表达A549细胞中的DBNL后,以WSN感染该细胞,在感染后24 h、48 h分别收集细胞上清,利用MDCK细胞进行噬斑滴定试验。试验结果显示,与对照组相比,下调表达DBNL后IAV的滴度极显著降低(P<0.01),表明下调表达DBNL能够抑制A549细胞中的IAV复制。利用siRNA下调表达A549细胞中的DBNL后,以WSN感染A549细胞,采用激光共聚焦试验鉴定IAV NP蛋白的表达与定位情况。结果显示,在病毒感染后6 h,对照组中红色荧光集中分布在细胞质中,而DBNL siRNA组中红色荧光在细胞核与细胞质中均有分布,表明下调表达DBNL能够抑制细胞中IAV NP蛋白的出核。反之,通过转染过表达DBNL的重组质粒,以WSN感染A549细胞,采用激光共聚焦试验鉴定IAV NP蛋白的表达与定位情况。结果显示,在病毒感染后4 h,转染pCAGGS的对照组中红色荧光主要分布在细胞核中,而过表达DBNL组中的红色荧光在细胞核与细胞质中均有分布,表明过表达DBNL能够促进细胞中IAV NP蛋白的出核。以上研究结果证实DBNL正调控IAV的复制与其NP蛋白的出核。本研究丰富了DBNL功能的多样性,为宿主因子调控IAV复制的研究提供参考数据。

关键词：流感病毒 DBNL蛋白 NP蛋白

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犬瘟热病毒F蛋白融合信号肽单克隆抗体的制备及其表位的鉴定

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中国预防兽医学报 2023年第5期45卷 523-528页

作者：崔赛赛李博韬刘家森康洪涛杨鸣发姜骞曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/宠物疫病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为制备犬瘟热病毒(CDV)F蛋白融合信号肽(FSP)的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达CDV HLJ1-13株重组FSP蛋白(rFSP)。将其免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌抗FSP蛋白MAb的杂交瘤细胞株G8D6E3E5,亚类鉴... 详细信息

为制备犬瘟热病毒(CDV)F蛋白融合信号肽(FSP)的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达CDV HLJ1-13株重组FSP蛋白(rFSP)。将其免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌抗FSP蛋白MAb的杂交瘤细胞株G8D6E3E5,亚类鉴定结果显示该株MAb重链为Ig G2a型,轻链为κ型。构建一系列表达部分重叠的重组FSP片段,经western blot鉴定该株MAb识别的抗原区域为aa1~aa55,通过合成一系列重叠多肽,经ELISA进一步鉴定该株MAb识别的抗原表位为^(21)QQHSTRSTET^(30)。采用western blot检测该株MAb与r FSP的反应原性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测该株MAb与天然FSP的反应原性。Western blot结果显示,CDV Snyder Hill和HLJ1-13株r FSP蛋白样品在34 ku左右均出现特异性条带;IFA结果显示,感染CDV Snyder Hill株48 h后的vero细胞出现红色荧光。以上结果表明,该株MAb既能够与原核表达的CDV Snyder Hill和HLJ1-13株的r FSP蛋白反应,也能够与天然表达的CDV Snyder Hill株FSP蛋白反应。上述研究结果为CDV的检测以及FSP生物学功能的研究奠定了坚实基础。

关键词：犬瘟热病毒 F蛋白融合信号肽单克隆抗体

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生物安全在养猪业的发展与应用

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黑龙江畜牧兽医 2024年第3期 38-44页

作者：李树稳李永锋张交儿孙元张新黄淑坚仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528231

随着规模化养猪的快速发展,烈性传染病造成的经济损失越来越大,而建立科学、高效的生物安全体系是有效预防和控制动物传染病的重要措施。在养猪生产过程中采取生物安全措施可以阻止或减少外部病原的引入(外部生物安全)及病原在养殖场内... 详细信息

随着规模化养猪的快速发展,烈性传染病造成的经济损失越来越大,而建立科学、高效的生物安全体系是有效预防和控制动物传染病的重要措施。在养猪生产过程中采取生物安全措施可以阻止或减少外部病原的引入(外部生物安全)及病原在养殖场内的传播(内部生物安全)。同时,科学的生物安全体系还有助于提高养殖生产效率、减少药物和疫苗的使用量。文章综述了目前国内养猪业主要采取的生物安全措施,同时系统分析了美洲和欧洲国家生物安全措施在猪场应用的发展历程,以期为完善我国养猪业生物安全防控体系提供借鉴。

关键词：生物安全养猪业疾病预防发展生物安全规范

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猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒三型、猪流感病毒三重RT-PCR检测方法建立及初步应用

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微生物学通报 2022年第12期49卷 5092-5099页

作者：王梦杰张文立王欣荣陈见兴夏长友陈洪岩张贺王玉娥中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

【背景】猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒三型(porcine circovirus typeⅢ,PCV3)和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)是3种影响猪只健康的重要呼吸道病原,对养猪业造成严重的经济损失,因此需要建立高效快速的检测方法,以了解3种病原在国内的流行情况。【目的】建立能同时检测PRRSV、PCV3和SIV的三重RT-PCR方法,为3种病毒的流行病学调查和疾病监控提供技术支持。【方法】针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪圆环病毒三型(PCV3),猪流感病毒(SIV)基因序列,分别设计3对特异性引物,扩增PRRSV M和N基因(436 bp)、PCV3 Cap基因(619 bp)和SIV M基因(199 bp)。通过对退火温度和引物浓度优化建立三重RT-PCR检测方法,并对建立的多重检测方法进行特异性、敏感性、重复性试验验证。【结果】建立了能够同时快速检测PRRSV、PCV3、SIV的三重RT-PCR方法,而对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus typeⅡ,PCV2)、猪细小病毒2型(porcine parvovirusⅡ,PPV2)、猪细小病毒3型(porcine parvovirusⅢ,PPV3)和猪细环病毒1型(torque teno sus virus I,TTSuV1)等6种病原的扩增均为阴性,特异性较好。敏感性结果显示,同时检测PRRSV、PCV3、SIV这3种病原的检测下限为100copies/μL,批间与批内试验结果均一致。用该方法对黑龙江省部分地区猪场的67份临床病料进行检测,结果显示PRRSV阳性率为16.5%,PCV3阳性率为10.5%,SIV阳性率为10.5%,而且存在混合感染。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,能够应用于临床样品检测,有效预测病原的流行情况。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒三型猪流感病毒三重RT-PCR

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