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甘草酸通过HMGB1/TLR4/JNK信号通路抗猪急性腹泻综合症冠状病毒感染的研究

中国预防兽医学报 2022年第10期44卷 1076-1083页

作者：冯书风时洪艳张记宇陈建飞张鑫张燎原冯廷帅景朝阳季朝阳石达冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

猪急性腹泻综合症冠状病毒(SADS-CoV)是一种新发现的肠道冠状病毒,引起仔猪严重的临床腹泻和肠道病理损害。为探究甘草提取物的主要成分甘草酸(GLY)抑制SADS-CoV复制的机制,本研究利用不同浓度的GLY对非洲绿猴肾细胞(Vero E6)和猪回肠... 详细信息

猪急性腹泻综合症冠状病毒(SADS-CoV)是一种新发现的肠道冠状病毒,引起仔猪严重的临床腹泻和肠道病理损害。为探究甘草提取物的主要成分甘草酸(GLY)抑制SADS-CoV复制的机制,本研究利用不同浓度的GLY对非洲绿猴肾细胞(Vero E6)和猪回肠上皮细胞(IPI-2I)预处理2 h并感染不同浓度的SADS-CoV后,分别经western blot和TCID_(50)检测,结果显示N蛋白的表达量显著减少且病毒滴度下降,表明GLY在体外能够抑制SADS-CoV的感染。利用不同浓度GLY对Vero E6和IPI-2I细胞预处理2 h后,感染灭活的SADS-CoV,western blot结果显示在GLY浓度为0.8 mmol/L时,N蛋白表达量显著减少,表明GLY能够抑制该病毒的侵入。选取0.4 mmol/L GLY处理细胞,再感染SADS-CoV后2 h、6 h、12 h收取细胞样品经western blot检测,结果显示各时间点N蛋白表达量均显著减少,表明GLY对该病毒的复制抑制效果显著。GLY是高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的竞争性抑制剂,而HMGB1的受体主要有TLR4和RAGE,因此构建了HMGB1关键性位点(C^(45)S、C^(106)S、C^(45/106)S)突变的质粒和RAGE受体的siRNA,分别转染Vero E6细胞并感染SADS-CoV,收获上清液和细胞样品,利用western blot和TCID_(50)检测。结果显示,N蛋白表达量显著减少且病毒滴度下降,表明GLY在SADS-CoV感染时通过影响HMGB1与TLR4和RAGE的结合而发挥功能。为了进一步探究GLY发挥作用的信号通路,分别将SADS-CoV感染Vero E6和IPI-2I细胞,收获细胞样品,利用western blot检测MAPK信号通路相关蛋白的变化,结果显示p-p38、p-JNK、p-ERK表达量在感染早期和晚期上调,表明SADS-CoV感染激活了MAPK通路。利用不同浓度的GLY和TLR4抑制剂TAK对Vero E6和IPI-2I细胞预处理2 h后感染SADS-CoV,收获蛋白样品,western blot结果显示p-JNK和N蛋白表达量显著减少,其他蛋白无明显变化,表明GLY和TAK调控JNK的磷酸化,而不能调控p38和ERK的磷酸化。利用HMGB1中和抗体预处理Vero E6细胞、将HMGB1的siRNA以及构建的HMGB1关键位点突变的真核表达质粒分别转染Vero E6细胞后感染SADS-CoV,收获上述细胞样品,western blot结果显示p-JNK的表达量均减少,表明HMGB1影响了JNK的磷酸化;利用不同浓度的JNK抑制剂SP600125对Vero E6和IPI-2I预处理2 h,再感染SADS-CoV,利用western blot、TCID_(50)和IFA检测,结果显示N蛋白表达量及病毒滴度均下降且病毒复制减少,表明SP600125抑制了病毒的复制。综上所述,本研究首次证实GLY主要通过HMGB1/TLR4/JNK信号通路抑制SADS-CoV的体外复制,该通路的发现为研究抗SADS-CoV的新型药物提供了数据支持。

关键词：甘草酸猪急性腹泻综合症冠状病毒感染高迁移率蛋白B1 JNK

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CRISPR-Cas12a在病原快速检测中的应用

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中国兽医科学 2022年第8期52卷 1031-1037页

作者：周旭王思文王秀荣中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

近年来,CRISPR-Cas系统病原核酸检测技术凭借其靶向精准、灵敏度高以及多重检测等特点,在即时检测(Point of Care testing,POCT)领域受到广泛关注。多种Cas蛋白具有顺式基因编辑功能和非特异性反式切割活性,基于这种特性成功实现了病原... 详细信息

近年来,CRISPR-Cas系统病原核酸检测技术凭借其靶向精准、灵敏度高以及多重检测等特点,在即时检测(Point of Care testing,POCT)领域受到广泛关注。多种Cas蛋白具有顺式基因编辑功能和非特异性反式切割活性,基于这种特性成功实现了病原核酸检测,极大改善了POCT产品灵敏度低的问题。其中,以Cas12为靶点并反式切割单链DNA探针的系统既简单又高效。因此,就CRISPR-Cas12a的历史、分类、检测原理和在核酸检测中的应用进展、开发检测试剂的困难等方面做一综述。

关键词： CRISPR-Cas系统 Cas12a 病原核酸检测

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细胞源禽流感病毒三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+Re-12株、H7N9 H7-Re3株)免疫效力研究

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中国预防兽医学报 2022年第3期44卷 295-300页

作者：刘艳晶潘舒心麻琦陈晓涵邓国华施建忠包红梅田国彬曾显营陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为评估重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗(细胞源,H5N1 Re-11株+Re-12株、H7N9 H7-Re3株)的免疫效力及对近期分离的H5和H7禽流感病毒(AIV)的免疫保护效果,本研究将3批疫苗以0.3 mL/只接种3周龄SPF鸡,疫苗接种后3周采集血清,检测针对H5... 详细信息

为评估重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗(细胞源,H5N1 Re-11株+Re-12株、H7N9 H7-Re3株)的免疫效力及对近期分离的H5和H7禽流感病毒(AIV)的免疫保护效果,本研究将3批疫苗以0.3 mL/只接种3周龄SPF鸡,疫苗接种后3周采集血清,检测针对H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re3株AIV的HI抗体效价;免疫后3周,以鼻腔感染的方式分别感染效力检验毒株和近期监测到的H5N1、H5N6和H7亚型AIV,进行攻毒效力试验。结果显示,3批疫苗接种SPF鸡3周时,血清中针对Re-11株、Re-12株和H7-Re3株抗原的平均HI抗体效价均在7.7log2~8.3log2,对照组鸡血清HI抗体均为阴性;分别以100 CLD50攻击H5亚型2.3.4.4h分支、2.3.2.1d分支AIV和H7N9亚型AIV效力检验毒株后14 d内,对照组鸡全部发病死亡且排毒,3批次疫苗免疫组鸡均不发病、不排毒、不死亡,获得完全保护。对近期分离H5和H7亚型AIV的免疫保护效力试验结果显示,接种0.3 mL/只疫苗3周的SPF鸡血清中针对3种抗原的平均HI抗体效价均在8log2左右。分别以105EID50攻击2019年分离的1株H5N6亚型、1株H5N1分离株、2株H7N9亚型AIV及2018年分离的H7N2亚型AIV后14 d内,对照组SPF鸡全部发病死亡,所有免疫组鸡均获得100%免疫保护。以上结果表明,细胞源重组AIV(H5+H7)三价灭活疫苗具有良好的免疫原性,能够完全抵御近期监测到的H7N9亚型AIV及H5N1和H5N6亚型AIV的攻击。本研究为细胞源AIV(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+Re-12株、H7N9 H7-Re3株)的研发和应用提供了依据。

关键词：禽流感 H5+H7 细胞源三价疫苗鸡免疫效力

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识别不同亚型鸭甲型肝炎病毒VP0蛋白单克隆抗体的制备及表位鉴定

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中国预防兽医学报 2023年第4期45卷 416-422页

作者：王欣荣张文立马文杰潘喻张贺徐云飞陈洪岩夏长友于海东王玉娥中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 哈尔滨维科生物技术有限公司黑龙江哈尔滨150069 西南大学动物医学院重庆400715

为制备鸭甲型肝炎病毒(DHAV)VP0蛋白的单克隆抗体(MAb),本实验经PCR扩增DHAV-1和DHAV-3的VP0基因并克隆至原核表达载体pMAL-c5x中分别构建重组质粒pMAL-c5x-DHAV1-VP0和pMAL-c5x-DHAV3-VP0。重组质粒均经PCR和测序鉴定正确后转化大肠杆... 详细信息

为制备鸭甲型肝炎病毒(DHAV)VP0蛋白的单克隆抗体(MAb),本实验经PCR扩增DHAV-1和DHAV-3的VP0基因并克隆至原核表达载体pMAL-c5x中分别构建重组质粒pMAL-c5x-DHAV1-VP0和pMAL-c5x-DHAV3-VP0。重组质粒均经PCR和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,采用IPTG诱导表达,并经亲和层析的方法纯化后,采用SDS-PAGE检测两个重组蛋白的表达与纯化效果。SDS-PAGE结果显示,分别在约70 ku处出现目的条带,且纯化后的条带较单一。表明两种重组VP0蛋白(DHAV-1 rVP0和DHAV-3 rVP0蛋白)均获得了表达,且纯化效果均较好。采用纯化的DHAV-1 VP0和DHAV-3 VP0蛋白交叉免疫BALB/c小鼠4次,并在冲击免疫后3 d收获小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA方法筛选能够稳定分泌DHAV-1 VP0及DHAV-3 VP0蛋白抗体且MBP蛋白抗体为阴性的杂交瘤细胞株,采用试剂盒鉴定MAb的亚类。结果显示,获得了针对DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白的MAb 1H10,且其为IgG1亚型,轻链为κ链。将构建的表达DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白的重组真核表达质粒经PCR和测序鉴定正确后分别转染HEK293T细胞,24 h后以该MAb作为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。结果显示,转染两种重组质粒的细胞均在35 ku处出现特异性条带,且细胞中均出现特异性绿色荧光,而转染空载体的对照细胞无该条带和绿色荧光。表明制备的MAb可以用于western blot和IFA鉴定DHAV-1和DHAV-3 VP0蛋白的表达。通过对VP0基因截短表达并采用western blot鉴定其识别的抗原表位,并对该表位的氨基酸序列与NCBI数据库中VP0蛋白的氨基酸序列比对。结果显示,MAb 1H10识别的线性表位为VP0蛋白的184LRTNTEIDL192,该表位与不同年代和不同地域分离的DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白相应氨基酸序列的同源性均为100%。表明该抗原表位在不同DHAV分离株中的保守性很高。本研究为DHAV检测方法的建立及具有广谱保护性表位疫苗的设计提供实验参考。

关键词：鸭甲型肝炎病毒单克隆抗体抗原表位

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荧光标记新城疫病毒在检测病毒入侵过程中的应用

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中国兽医科学 2022年第7期52卷 853-860页

作者：刘添仪孙军峰师乾凯赵冉邸涛张春玮陈林娜张智颖韩宗玺刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

本研究利用荧光染料标记的新城疫病毒(NDV)检测病毒的吸附、融合和进入,旨在为研究NDV入侵细胞的机制提供一种工具。首先通过DiOC标记NDV(DiOC-NDV)检测病毒的吸附和进入,随后利用R18标记NDV(R18-NDV)检测病毒的融合,最后利用R18和DiOC... 详细信息

本研究利用荧光染料标记的新城疫病毒(NDV)检测病毒的吸附、融合和进入,旨在为研究NDV入侵细胞的机制提供一种工具。首先通过DiOC标记NDV(DiOC-NDV)检测病毒的吸附和进入,随后利用R18标记NDV(R18-NDV)检测病毒的融合,最后利用R18和DiOC同时标记NDV(DiOC/R18-NDV)进一步检测NDV在内体中的融合。病毒吸附的检测结果显示,代表NDV的绿色荧光定位于细胞表面。病毒进入的检测结果显示,60~120 min不能被台盼蓝淬灭以及被台盼蓝淬灭的绿色荧光强度均无明显变化(P>0.05);病毒融合的检测结果显示,30~120 min时均能在细胞表面和细胞质中观察到红色荧光,且60~120 min时细胞的总荧光强度无显著差异(P>0.05)。以上结果表明,NDV吸附细胞后,在细胞表面与内体中发生膜融合及进入,且该过程在60 min内完成。综上所述,荧光标记的NDV能直观、可靠地展现病毒的吸附、进入和融合过程,荧光标记NDV可作为一种研究NDV入侵细胞机制的工具。

关键词：新城疫病毒荧光标记 DiOC R18

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H5亚型2.3.4.4分支禽流感病毒HA基因重组质粒的免疫保护效力研究

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中国预防兽医学报 2022年第1期44卷 53-58,79页

作者：李炯颉梁真洁陈普成曾显营柳金雄邓国华姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为研制H5亚型禽流感病毒(AIV)流行株的DNA疫苗,本研究将目前流行的H5亚型2.3.4.4分支AIV代表株A/Duck/Guizhou/S4184/2017(H5N6)[简称DK/GZ/S4184/2017(H5N6)]的HA基因经密码子优化后克隆至载体pCAGGs中构建重组质粒pCA-S4184,经PCR和测序鉴定正确后转染293T细胞,利用间接免疫荧光试验和western blot鉴定。结果显示,该HA基因可以在293T细胞中瞬时表达。将15μg/只的重组质粒pCA-S4184经肌肉注射免疫3周龄SPF鸡,3周后以相同的剂量加强免疫,1周后再通过滴鼻途径分别以10^(5)EID_(50)/0.1 mL/只的同源高致病性AIV(HPAIV)DK/GZ/S4184/2017(H5N6)株和同分支异源HPAIV DK/GD/S1110/2019(H5N6)、DK/GX/1/2018(H5N6)、DK/HuN/SE0110/2018(H5N6)株攻毒,首免及攻毒后每周采血,检测每组鸡的HI抗体水平。在攻毒后14 d的观察期内每天记录各组鸡的发病和死亡情况,攻毒后第3 d、5 d和7 d采集所有鸡的喉头和泄殖腔拭子进行病毒的分离及其滴度的测定。结果显示,加强免疫后各组鸡的平均HI抗体滴度为1:8~1:11,攻毒后HI抗体效价均显著增加;pCA-S4184可以对SPF鸡提供抵抗致死性同源病毒和同分支异源病毒攻击的能力,保护率达到100%,且能显著降低SPF鸡的排毒量甚至不排毒。随后以15μg/只的pCA-S4184两次免疫3周龄SPF鸡,免疫后每隔2周采血检测HI抗体的动态消长规律并在首免后第12周和24周,分别随机选取8只免疫鸡和8只对照鸡通过滴鼻途径以10^(5)EID_(50)/0.1 mL/只感染同源HPAIV DK/GZ/S4184/2017(H5N6)株,并在攻毒后第3 d、第5 d和第7 d采集所有鸡的喉头和泄殖腔拭子,分离病毒并测其滴度,以评估该重组质粒在免疫持续期间所诱导的免疫保护效果。结果显示,重组质粒仍可以使免疫鸡完全抵抗同源病毒的攻击。本研究为重组质粒pCA-S4184作为防控H5亚型2.3.4.4分支禽流感的候选DNA疫苗提供了实验依据。

关键词： DNA疫苗 2.3.4.4分支禽流感病毒免疫效力评估

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鸡腺病毒血清4型和11型Penton蛋白的表达及交叉反应性评价

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中国兽医科学 2022年第6期52卷 704-711页

作者：秦亚平刘亮亮刘胜旺李慧昕中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了了解不同血清型鸡腺病毒(fowladenovirus,FAdV)表面蛋白的交叉反应性,本研究对FAdV-4(HN/151025株)和FAdV-11(LN/1507株)型病毒的衣壳蛋白之一的Penton蛋白分别进行原核表达以及真核表达,并分别与FAdV-11和FAdV-4型血清进行交叉反应... 详细信息

为了了解不同血清型鸡腺病毒(fowladenovirus,FAdV)表面蛋白的交叉反应性,本研究对FAdV-4(HN/151025株)和FAdV-11(LN/1507株)型病毒的衣壳蛋白之一的Penton蛋白分别进行原核表达以及真核表达,并分别与FAdV-11和FAdV-4型血清进行交叉反应,评价FAdV-4与FAdV-11型毒株Penton蛋白的交叉反应性。Western-blot检测结果显示,FAdV-4型的Penton蛋白与同型血清有良好的反应性,但与FAdV-11型的血清无交叉反应性;FAdV-11型的Penton蛋白与同型血清有良好的反应性,同时与FAdV-4型的血清有微弱的交叉反应。上述结果表明,FAdV-4型血清可同时识别FAdV-4型和FAdV-11型病毒的Penton蛋白。对2株病毒Penton蛋白的氨基酸序列进行比对,结果显示,两种血清型毒株的Penton蛋白的N端差异较大,这个差异区可能与蛋白的主要抗原表位区相关,进而影响血清学交叉反应性及交叉反应的强度,这可能是造成两种血清型毒株Penton蛋白交叉反应差的原因之一。

关键词：鸡腺病毒血清4型血清11型 Penton蛋白交叉反应

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一株基因V型禽呼肠孤病毒的分离鉴定与致病性研究

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中国兽医科学 2022年第5期52卷 603-609页

作者：刘芮罗丹李凯刘长军祁小乐张艳萍崔红玉潘青高玉龙高立中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了了解禽呼肠孤病毒(ARV)在我国的流行情况及其生物学特性和致病特点,通过细胞传代、RT-PCR检测及序列分析,从山东省送检的病鸡关节组织中成功分离到1株病毒,将其命名为ARV-SD20-3203,样品中未检测到其他常见外源禽类病毒的核酸。禽... 详细信息

为了了解禽呼肠孤病毒(ARV)在我国的流行情况及其生物学特性和致病特点,通过细胞传代、RT-PCR检测及序列分析,从山东省送检的病鸡关节组织中成功分离到1株病毒,将其命名为ARV-SD20-3203,样品中未检测到其他常见外源禽类病毒的核酸。禽呼肠孤病毒主要保护性抗原σC基因的遗传进化分析结果表明,ARV-SD20-3203属于ARV基因V型,与基因Ⅴ型参考毒株918和1017-1的遗传距离较近,其氨基酸序列同源性分别为93.0%和92.4%,而与其他基因型毒株的遗传距离较远。ARV-SD20-3203毒株在LMH细胞上增殖良好;对鸡胚和雏鸡均具有明显的致病性,接种鸡胚可引起100%死亡,接种1日龄SPF雏鸡可引起75%死亡,其中SPF雏鸡接种病毒后第5天为死亡高峰期,第8天之后,不再出现SPF雏鸡死亡。该研究分离到1株基因V型ARV毒株,这为了解我国ARV变异株的流行及遗传进化特征提供了重要的材料。

关键词：禽呼肠孤病毒变异株遗传进化致病性

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欧洲型和美洲型PRRSV的最新分类及其差异的研究进展

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 1006-1013页

作者：孙琪许浒李超李宛生张洪亮田志军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种能够引起重大经济损失的高度接触性、高死亡率猪传染性疾病,主要以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为临床特征,其病原为PRRS病毒(PRRSV),该病原自2018年起... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种能够引起重大经济损失的高度接触性、高死亡率猪传染性疾病,主要以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为临床特征,其病原为PRRS病毒(PRRSV),该病原自2018年起归属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)、β-动脉炎病毒属(Betaarterivirus)。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征母猪繁殖障碍重大经济损失动脉炎病毒属猪呼吸道疾病美洲型动脉炎病毒科 PRRS病毒

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非洲猪瘟流行病学及诊断技术研究进展

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中国兽医学报 2022年第5期42卷 1066-1076页

作者：宋浩张丽张交儿仇华吉罗玉子中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪的一种烈性、出血性、高度接触性传染病,致死率高达100%。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物传染病。... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪的一种烈性、出血性、高度接触性传染病,致死率高达100%。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物传染病。目前尚无商品化疫苗和有效的治疗方法。2018年8月,ASF首次传入我国,随后迅速大范围蔓延,造成我国生猪存栏量急剧下降,猪肉价格大幅度上涨,给我国养猪业和食品经济造成了严重冲击。虽然目前生猪产能有较大恢复,但是ASF防控压力有增无减。2020年以来,各地陆续出现了ASFV变异株(基因Ⅱ型)和基因Ⅰ型弱毒株,与初期流行的毒株(基因Ⅱ型)相比,变异株潜伏期延长、感染猪临床症状不明显、死亡率降低,难以早期发现,给猪场ASF防控带来了新的挑战。因此,快速可靠的诊断技术和病原流行病学研究对ASF防控至关重要。本文对ASFV病原学、流行病学和实验室诊断技术进行了分析和梳理,以期为ASF流行趋势、诊断及防控提供技术参考。

关键词：非洲猪瘟流行病学变异株诊断技术

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