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病毒学报 2007年第6期23卷 471-476页

作者：杨涛刘明刘春国张云刘大飞陈浩童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

为拯救出一株能够在动物传代细胞中高水平复制的H3N2亚型猪流感疫苗株,利用反向遗传操作技术,将A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)毒株的PB1、PA、NP、M、NS基因和A/PR/8/34毒株的PB2基因作为内部基因与猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒... 详细信息

为拯救出一株能够在动物传代细胞中高水平复制的H3N2亚型猪流感疫苗株,利用反向遗传操作技术,将A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)毒株的PB1、PA、NP、M、NS基因和A/PR/8/34毒株的PB2基因作为内部基因与猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株的HA、NA基因进行重组,成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株rH3N2株,该毒株接毒MDCK细胞60h后,血凝价可以达到1∶512,表明该毒株具有高度适应细胞繁殖特性,为H3N2亚型猪流感病毒细胞培养型疫苗的研制奠定了基础。

关键词：猪流感 H3N2亚型反向遗传操作技术细胞培养型流感疫苗

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H7亚型禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

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生物工程学报 2009年第11期25卷 1658-1663页

作者：包红梅王秀荣陶启蒙蔡东东王馥梅陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室侬业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

通过分析流感数据库45个H7亚型禽流感病毒的HA序列,在保守区内设计并合成引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,扩增片段大小为501bp。通过对H7亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液不同滴度检测,证实病毒尿囊液最低检出量为105.5EID50/mL;... 详细信息

通过分析流感数据库45个H7亚型禽流感病毒的HA序列,在保守区内设计并合成引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,扩增片段大小为501bp。通过对H7亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液不同滴度检测,证实病毒尿囊液最低检出量为105.5EID50/mL;阳性棉拭子最低检出量为103EID50/mL。用该方法检测H1～H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原进行检测,仅有H7亚型AIV有特异性目的条带,与其他均无交叉反应。从脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品的病毒分离和RT-PCR方法比较,表明在10-1的样品浓度下,两者可以达到相同的检出量。表明该一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高和准确率高的特点。

关键词：禽流感病毒反转录聚合酶链反应 H7N1 亚型鉴别

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H3N2亚型猪流感病毒的拯救及HA与NA基因的替换

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微生物学报 2009年第6期49卷 813-819页

作者：杜金玲刘明刘春国杨涛李洪涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

【目的】为研究流感病毒突破种间屏障分子机制,筛选流感基因工程疫苗株。【方法】本试验以猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)为亲本株,利用反向遗传学操作技术,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体p... 详细信息

【目的】为研究流感病毒突破种间屏障分子机制,筛选流感基因工程疫苗株。【方法】本试验以猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)为亲本株,利用反向遗传学操作技术,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,拯救出全部基因均来自于亲本株的猪流感病毒rgH3N2,并分别以人流感病毒A/PR/8/34(H1N1)、禽流感病毒A/Duck/Nanchang/4-165/2000(H4N6)、马流感病毒A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)的HA和NA基因替换A/Swine/Henan/S4/01的相应基因。【结果】生物学试验结果表明rgH3N2在鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。rgH3N2经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1∶256,接种MDCK细胞60h后,血凝价可以达到1∶64。基因替换后成功拯救出的重组病毒rgH1N1、rgH4N6和rgH3N8在鸡胚和细胞上均具有较高的增殖能力。【结论】病毒的成功拯救为流感病毒突破种间屏障分子机制,HA、NA基因在流感病毒跨种属传播中所扮演角色的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

关键词：猪流感反向遗传 RT-PCR H3N2亚型病毒拯救

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H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA方法的初步建立

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微生物学报 2008年第2期48卷 220-225页

作者：万春和刘明刘春国张晓霁杨涛刘大飞陈浩齐金龙乔传玲中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物,扩增出HA基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得... 详细信息

根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物,扩增出HA基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子(rBacmid-H1),在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBV-H1),再感染细胞,收获目的蛋白。通过血凝试验、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性。利用表达的蛋白作为猪流感间接ELISA的抗原,初步建立H1亚型猪流感的间接ELISA检测方法,并对内蒙古、辽宁和黑龙江等地送检的93份猪血清进行了检测,阳性率为31.18%,为研制开发快速、准确、简便的H1亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定基础。

关键词： H1亚型猪流感病毒血凝素基因昆虫细胞杆状病毒表达间接ELISA

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欧亚类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的表达及免疫原性评估

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中国农业科学 2019年第5期52卷 930-938页

作者：贾云慧许程志隋金钰吴运谱许榜丰陈艳杨焕良乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

【目的】表达欧亚类禽型(eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013(H1N1)(ZJ245)的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光(IFA)检测和Western blot检测HA蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)经肌肉注射途径、以100μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠(I组和II组),间隔3周后进行加强免疫(二免);同等数量的小鼠以相同方式注射100μL无菌PBS作为非免疫对照组(III组和IV组)。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制(HI)试验和病毒中和(VN)试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠(I组和III组)用50μL(106.0EID50)的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组(II组和IV组)用A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)(HLJ44)病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫保护效果。【结果】经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的HA基因的已正确克隆至真核表达质粒p CAGGS中获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的HA蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN抗体。106.0 EID50的同源病毒ZJ245攻毒时,与非免疫组小鼠相对比,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫完全阻止了因病毒攻击而导致的小鼠体重下降以及肺脏和鼻甲内病毒的复制;106.0 EID50的异源病毒HLJ44攻毒时,相比非免疫组小鼠,质粒免疫组小鼠体重的下降比率、以及肺脏和鼻甲内的病毒滴度均显著降低(P<0.0001、P <0.001、P <0.05)。【结论】重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)能够有效表达病毒HA蛋白,免疫后可使小鼠获得完全抵抗ZJ245感染及部分抵御HLJ44感染的免疫保护力,表明重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)具有良好的免疫原性。

关键词：欧亚类禽型H1N1猪流感病毒 HA蛋白重组质粒免疫原性 DNA疫苗

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流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1的相互作用

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中国农业科学 2018年第17期51卷 3389-3396页

作者：赵青青李俊平梁立滨黄山雨周陈陈赵玉辉王倩周圆姜丽陈化兰李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1(poly(r C)-binding protein... 详细信息

【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1(poly(r C)-binding protein 1,PCBP1)。【目的】探索PCBP1蛋白与流感病毒PA蛋白的互作关系及其对流感病毒复制的影响,为深入理解流感病毒在宿主体内的复制调控机制提供数据。【方法】将诱饵质粒pGBKT7-PA与筛选到的重组质粒p GADT7-PCBP1以及阴性对照组和阳性对照组按照醋酸锂法分别共转化酵母感受态细胞,并涂布在3种营养缺陷型培养基上,30℃倒置培养5—7 d,观察酵母菌落生长情况和菌落颜色,回交验证PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中的相互作用。参照GenBank中录入的PA蛋白和人源PCBP1蛋白的序列,分别设计特异性扩增引物,构建真核重组表达质粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1,将这两种真核表达质粒分别单独转染或共同转染HEK293T细胞,于转染48 h后裂解细胞,收获上清,留取少部分作对照,余下的样品逐步加入FLAG单抗和Protein G琼脂糖珠子进行免疫共沉淀(Co-IP),经SDS-PAGE和Western blot检测PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用。利用慢病毒包装系统pLVX-IRES-Zs Green1在HEK293T细胞中包装假病毒,将假病毒侵染A549细胞后经超速流式分选构建PCBP1蛋白过表达细胞系,Western blot检测PCBP1过表达情况,然后用流感病毒WSN以0.01 MOI感染该过表达细胞系,于感染后24和48 h收获上清,对上清中的流感病毒进行蚀斑计数。合成PCBP1蛋白的si RNA,转染A549细胞下调PCBP1蛋白的表达,干扰后48 h通过Western blot检测PCBP1蛋白表达下调情况,并以MOI=0.01感染流感病毒WSN,收获感染后24和48 h的上清,进行蚀斑滴定计数。【结果】通过酵母回交验证发现诱饵质粒pGBKT7-PA与重组阳性质粒p GADT7-PCBP1的共转酵母菌落可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A等3种营养缺陷型平板上正常生长,并且能分解底物X-α-Gal,使菌落呈现蓝色,与阳性对照组一致,表明PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中存在相互作用。免疫共沉淀试验发现PA蛋白可以将PCBP1蛋白沉淀下来,说明PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用。在PCBP1过表达细胞系中,PCBP1蛋白表达水平显著提高,流感病毒的复制滴度下降;而通过si RNA干扰后,PCBP1表达水平显著下降,流感病毒的复制滴度升高,表明PCBP1对流感病毒复制具有负调控作用。【结论】通过研究发现流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在相互作用,且宿主蛋白PCBP1对流感病毒的复制具有负调控作用。

关键词：酵母双杂交流感病毒 PA蛋白 PCBP1蛋白蛋白互作

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猪断奶后多系统消瘦综合症

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黑龙江畜牧兽医 2002年第3期 27-28页

作者：金红李媛宋晓华于康震宋淑萍哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

猪断奶后多系统消瘦综合症 (post-weaningmultisystemicwastingsyndrome ,PMWS)是近年来危害养猪业比较严重的疾病之一 ,它广泛存在于欧洲、亚洲和美洲等许多国家和地区 ,现日益受到各国的重视。现就该病的特征、分布及流行情况。

关键词：猪断奶消瘦综合症

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NS2A序列对日本脑炎病毒NS1基因在原核系统中的体外表达的影响

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中国农业科学 2004年第4期37卷 614-618页

作者：仇华吉金吉东田志军周艳君王云峰童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 哈尔滨150001 延边大学农学院动物医学系龙井133400 哈尔滨150001 哈尔滨150001 哈尔滨150001 哈尔滨150001

用RT-PCR扩增并克隆了日本脑炎病毒弱毒株SA14-14-2的NS1、NS1’、NS1-2A的 cDNA片段,分别将其亚克隆到原核表达载体pET-30b(+),构建了重组原核表达质粒pET30b-NS1、pET30b-NS1’、pET30b-NS1-2A,转化大肠杆菌BL-21(DE3),用IPTG诱导培养。结果表明,仅有pET30b-NS1质粒转化的菌株获得表达,而另外2种重组质粒转化的菌株均无表达。表达的融合蛋白分子量约为46kD,约占菌体总蛋白的30.8%,Western blotting分析表明表达产物具有抗原活性。动物试验证实,重组NS1免疫小鼠蛋白可以抵抗强毒的攻击。笔者研究证实NS2A或部分NS2A的存在对于NS1的表达具有不利影响。

关键词：日本脑炎病毒 NS1 NS1’ RT-PCR 基因表达

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表达O型口蹄疫病毒VP1基因的重组病毒BHV-1的构建与鉴定

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微生物学报 2009年第5期49卷 677-682页

作者：任宪刚薛飞朱远茂童光志王延辉冯军科祖立闯李娇史鸿飞高欲燃中国农业科学院哈尔滨兽医研究所大动物传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

【目的】为了构建表达口蹄疫病毒(O/China/99)VP1基因的牛疱疹病毒1型,将人工合成的口蹄疫病毒VP1基因插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建gE基因缺失转移载体。【方法】利用磷酸钙介导转染法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/gE-/LacZ+的... 详细信息

【目的】为了构建表达口蹄疫病毒(O/China/99)VP1基因的牛疱疹病毒1型,将人工合成的口蹄疫病毒VP1基因插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建gE基因缺失转移载体。【方法】利用磷酸钙介导转染法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/gE-/LacZ+的基因组DNA共转染牛鼻甲细胞后收获增殖的病毒。通过筛选白色病毒蚀斑,得到重组病毒BHV-1/gE-/VP1。【结果】PCR检测结果表明VP1基因已经插入到了重组病毒BHV-1/gE-的基因组中,间接免疫荧光试验和Western blot证实了BHV-1/gE-/VP1中的VP1基因在感染的细胞中获得了表达。【结论】本研究成功地构建了表达口蹄疫病毒VP1基因的重组病毒BHV-1/gE-/VP1,为研制口蹄疫及其他重要牛传染病的BHV-1病毒载体疫苗奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 VP1基因牛疱疹病毒1型磷酸钙介导转染

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马γ-干扰素双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第5期24卷 464-466页

作者：白宇童铁钢张维军徐树兰王群刘光亮吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

目的:建立检测马γ-干扰素的双抗体夹心ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法。方法:将识别不同表位的抗马γ-干扰素的2株单克隆抗体(mAb,A5和SB10)纯化后,利用生物素标记试剂盒对其中1株纯化的mAb(SB10)进行标记,通过对重组马IFN-... 详细信息

目的:建立检测马γ-干扰素的双抗体夹心ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法。方法:将识别不同表位的抗马γ-干扰素的2株单克隆抗体(mAb,A5和SB10)纯化后,利用生物素标记试剂盒对其中1株纯化的mAb(SB10)进行标记,通过对重组马IFN-γ进行ELISA检测来建立马γ-干扰素双抗体夹心ELISA。结果:经过方阵滴定实验确定捕获抗体的最佳浓度为1mg/L,检测抗体的工作效价为1∶1000。利用建立的方法对不同稀释度的重组马γ-干扰素和丝裂原刺激的马外周血单核细胞培养上清进行检测。结论:此方法检测敏感度达到1μg/L,特异性良好,为马的细胞免疫学研究提供了方法,并为建立马γ-干扰素ELISPOT检测方法奠定了基础。

关键词：马γ-干扰素夹心ELISA

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