人类WNK4(Human With No lysine[K]kinase 4,hWVK4)基因编码一种特殊类型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该基因的错义突变可导致一种遗传性高血压——Ⅱ型假性低醛固酮血症(Pseudohypoaldosteronism typeⅡ,PHAⅡ,OMIM,No.145260),其主要临...
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人类WNK4(Human With No lysine[K]kinase 4,hWVK4)基因编码一种特殊类型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该基因的错义突变可导致一种遗传性高血压——Ⅱ型假性低醛固酮血症(Pseudohypoaldosteronism typeⅡ,PHAⅡ,OMIM,No.145260),其主要临床表现为高血压和高血钾。研究表明WNK4激酶主要表达在肾脏,通过调节肾脏远曲小管和集合管上的多种离子转运体和离子通道参与机体水盐代谢和血压调节。目前关于hWK4基因的研究主要集中在功能方面,而hWNK4基因表达调控机制研究较少。生物信息学分析显示hWNK4基因近端启动子区未见典型的TATA盒,但富含GC序列和一些潜在的转录因子作用元件,如Sp1、AP-1和C/EBP等。为检验转录因子Sp1是否参与hWNK4基因表达调控,本研究选用人胚肾细胞系HEK293细胞为细胞模型,应用不同浓度的Sp1特异性抑制剂Mithramycin A处理细胞,24小时后收集细胞,提取RNA,紫外分光光度计检测标本RNA纯度和浓度后,利用试剂盒将mRNA反转录成cDNA,采用Real-time PCR技术检测处理前后HEK293细胞中WVK4基因mRNA表达水平变化情况。结果显示Mithramycin A负性调节HEK293细胞中WNK4基因mRNA表达,且随着Mithramycin A作用浓度增大,下调效应增强,具有浓度依赖性。该结果提示转录因子Sp1可能参与WNK4基因表达调控。
目的MYCT1（myc target 1）基因是我室克隆的喉癌候选肿瘤抑制基因,GenBank登录号NM25107,曾用名MTLC（myc target from laryngeal cancer cells）。本研究旨在克隆该基因新转录本全长,确定其转录起始点,并探讨该基因启动子的结构与功...
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目的MYCT1（myc target 1）基因是我室克隆的喉癌候选肿瘤抑制基因,GenBank登录号NM25107,曾用名MTLC（myc target from laryngeal cancer cells）。本研究旨在克隆该基因新转录本全长,确定其转录起始点,并探讨该基因启动子的结构与功能。方法利用已知MYCT1的保守序列,以正常人血液RNA为模板,应用RACE（rapid-amplification ofcDNA ends）技术克隆得到该基因精确全长,确定转录起始点位置并提交GenBank;然后利用生物信息学软件对所得cDNA序列及其启动子区进行预测分析,以人类基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到P852（-852～+12bp）、P799（-799～+12bp）、P667（-667～+12bp）三段不同长度的启动子片段,将其定向克隆入pGL3Basic载体,将构建好的荧光素酶报告基因表达载体瞬时转染喉癌Hep2细胞系和人胚肾HEK293细胞系,并采用凝胶电泳迁移实验结合染色质免疫共沉淀实验分别从体外和体内验证MYCT1基因启动子活性。结果克隆得到长1106bp的MYCT1基因新转录本（MYCT1transcript variant 1）,GenBank登录号GU97693,转录起始点位于ATG上游140bp处,这一新的转录本的氨基酸序列与小鼠mt-mc1基因同源性达85%;启动子区研究结果发现在两个细胞系中P667几乎没有荧光素酶活性,而P853、P799存在明显的荧光素酶活性,表明启动子区位于ATG上游852～799bp区域,凝胶电泳迁移实验和染色质免疫共沉淀实验表明该区域与转录因子C-MYC特异性结合。结论成功克隆了MYCT1基因新的转录本和具有活性的该基因启动子,精确定位转录起始点,C-MYC为该基因启动子区重要的转录因子,为进一步研究MYCT1基因的转录调控机制及基因功能奠定了实验基础。
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