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Survivin基因启动子的克隆及在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性研究

河北医科大学学报 2011年第2期32卷 134-137页

作者：金红婷张珊珊王宝利李晓霞浙江中医药大学骨伤研究所浙江杭州310053 天津医科大学代谢病医院内分泌研究所生化与分子生物学研究室天津300070 天津医科大学基础医学院微生物学教研室天津300070

目的研究Survivin基因启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性。方法采用非限制酶方法获得具有酶切黏性末端的Survivin最小启动子,将其克隆到含有报告基因增强绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)的载体pEGFP-1和含... 详细信息

目的研究Survivin基因启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性。方法采用非限制酶方法获得具有酶切黏性末端的Survivin最小启动子,将其克隆到含有报告基因增强绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)的载体pEGFP-1和含有荧光素酶Luciferase的质粒载体pGL3-Basic,经脂质体分别转染人正常乳腺上皮细胞系HBL-100和乳腺癌细胞MCF-7,荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,同时测定2种细胞中荧光素酶表达的差异。结果 Smvivin启动子在MCF7细胞中呈现高转录活性;而在HBL100细胞中转录活性极低。结论 Survivin启动子在肿瘤细胞MCF7中具有很强的特异性,为进一步开发肿瘤特异性基因治疗奠定了实验基础。

关键词：乳腺肿瘤启动区(遗传学) 克隆,生物

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斑马鱼红系造血缺陷突变体的正向遗传学筛选

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南方医科大学学报 2010年第5期30卷 931-935页

作者：霍中军温宗华刘靖王鹍黄志斌戴朝霞马宁颜广陈英华陈小辉刘伟马品芸罗伟豪赵颖樊淑赵嘉佳黄红辉温子龙张文清南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室广东广州510515 南方医科大学基础医学院病理学教研室广东广州510515 南方医科大学基础医学院病组织胚胎学教研室广东广州510515 南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室广东广州510515 香港科技大学生化系香港

目的化学遗传学方法大规模筛选并初步鉴定所获得具有不同红系造血缺陷表型的斑马鱼突变体。方法乙基亚硝基脲(ENU)诱导雄性斑马鱼突变(founder),将其与野生型AB雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同来源的founder的F1代杂交产生F2家族。在F... 详细信息

目的化学遗传学方法大规模筛选并初步鉴定所获得具有不同红系造血缺陷表型的斑马鱼突变体。方法乙基亚硝基脲(ENU)诱导雄性斑马鱼突变(founder),将其与野生型AB雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同来源的founder的F1代杂交产生F2家族。在F2代同家族内自交所产生的F3代胚胎中,用以βe1为探针,实施整体原位杂交实验,进行红系造血缺陷突变体筛选,并针对所筛选到的突变体在不同造血过程缺陷表型进行分类研究。结果和结论筛选得到4个βe1基因表达缺失突变体,其中2个为红系特异性造血缺陷突变体,另外2个突变体同时存在红系和淋系造血缺陷。

关键词：斑马鱼红系造血正向遗传学筛选 βe1-globin

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斑马鱼髓系造血细胞缺陷突变体的大规模遗传筛选

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南方医科大学学报 2010年第6期30卷 1230-1233页

作者：戴朝霞颜广陈英华刘伟霍中军温宗华刘靖王鹍黄志斌马宁陈小辉马品芸罗伟豪赵颖樊淑黄红辉温子龙张文清南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室广东广州510515 南方医科大学基础医学院组织胚胎学教研室广东广州510515 南方医科大学基础医学院病理学教研室广东广州510515 南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室广东广州510515 香港科技大学生化系

目的通过大规模化学遗传学方法筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体。方法利用化学诱变剂乙基亚硝基脲(ENU)将雄鱼精原母细胞诱变,通过与AB野生型雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同founder(F0)的F1代同胞之间交配产生F2家族,F3代来F2家族同胞... 详细信息

目的通过大规模化学遗传学方法筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体。方法利用化学诱变剂乙基亚硝基脲(ENU)将雄鱼精原母细胞诱变,通过与AB野生型雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同founder(F0)的F1代同胞之间交配产生F2家族,F3代来F2家族同胞内交配,并分别以中性红和苏丹黑B染色筛选巨噬细胞和粒细胞缺陷突变体。结果我们筛选了350个F2家族,共1424对鱼。初步筛选到6个斑马鱼髓系造血系统的突变体,其中3个突变体为中性红染色异常,另3个突变体为苏丹黑染色异常,表明以上突变体可能存在巨噬细胞或粒细胞的发育障碍。结论 ENU化学诱变和中性红及苏丹黑B染色筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体是简单、价廉、有效的化学遗传学方法。通过保留突变体对后代进行进一步的研究分析,有望鉴定和克隆影响斑马鱼髓系造血新的基因或已知基因的新的调控途径。

关键词：斑马鱼髓系造血正向遗传学筛选苏丹黑中性红

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转化生长因子β1对口腔鳞状细胞癌脑转移细胞系Tb细胞生长抑制作用的研究

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中华口腔医学杂志 2010年第7期45卷 421-425页

作者：刘成敏张成仁王秀梅徐旭光傅松滨哈尔滨医科大学附属第二医院口腔科 150086 哈尔滨医科大学基础医学院遗传学教研室黑龙江省生物医药工程重点实验室

目的探讨转化生长因子（transforming growth factor,TGF）β1对口腔鳞状细胞癌脑转移细胞系Tb细胞的生长抑制作用及可能的机制.方法采用细胞计数法检测TGF-β1对Tb细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期的变化,微阵列分析法（su... 详细信息

目的探讨转化生长因子（transforming growth factor,TGF）β1对口腔鳞状细胞癌脑转移细胞系Tb细胞的生长抑制作用及可能的机制.方法采用细胞计数法检测TGF-β1对Tb细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期的变化,微阵列分析法（superarray）筛查smad蛋白介导的TGF-B（TGF-β-Smads）信号通路中基因表达水平的变化,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）验证差异表达基因.结果 TGF-β1对Tb细胞有明显的生长抑制作用（P〈0.05）.流式细胞仪检测显示,TGF-β1能够使Tb细胞周期阻滞于G1期（P〈0.05）.微阵列分析法筛查结果显示,TGF-β1作用后,活化素受体样激酶1（activin receptor-like kinase-1,ACVRL-1）、抗苗勒激素（anti-mullerian hirmine,AMH）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2B（cyclim-dependent kinase inhibitor-2B,CDKN-2B）、TGF-相互作用因子（indnced factor,TGIF）基因表达增加,而畸形肿瘤衍生生长因子1（teratocarcinomaderived growth factor-1,TDGF-1）基因表达降低.RT-PCR验证结果表明,ACVR-1（0.67±0.08）、CDKN-2B基因表达（2.16±0.95）与微阵列分析法结果一致,差异有统计学意义（P〈0.05）,AMH（0.38±0.07）、TDGF-1（0.44±0.06）及TGIF（0.52±0.10）基因表达水平无统计学意义（P〉0.05）.结论 TGF±β1对口腔鳞状细胞癌脑转移细胞系Tb细胞有明显的生长抑制作用,其机制可能与细胞周期调控及调节TGF-β1-Smads信号通路中ACVRL-1、CDKN-2B基因表达有关.

关键词：转化生长因子β1 癌鳞状细胞基因表达

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IL-12基因联合吡柔比星治疗裸鼠膀胱癌移植瘤的实验

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肿瘤防治研究 2010年第11期37卷 1241-1244页

作者：王凤岐赵维明张诚金承俊张子健钟照华修有成哈尔滨医科大学附属第一医院泌尿外科哈尔滨150010 哈尔滨医科大学基础医学院微生物教研室

目的探讨联合应用白细胞介素12(IL-12)质粒和吡柔比星(THP)对人膀胱癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法将人EJ膀胱癌细胞株裸鼠腋下接种,成瘤后设4组(每组6只):联合组于骨骼肌注射IL-12真核表达质粒pcAGGS-mIL-12和腹腔注射THP;IL-12组... 详细信息

目的探讨联合应用白细胞介素12(IL-12)质粒和吡柔比星(THP)对人膀胱癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法将人EJ膀胱癌细胞株裸鼠腋下接种,成瘤后设4组(每组6只):联合组于骨骼肌注射IL-12真核表达质粒pcAGGS-mIL-12和腹腔注射THP;IL-12组骨骼肌注射pcAGGS-mIL-12;THP组腹腔注射THP;对照组肌肉及腹腔注射0.9%氯化钠溶液,以上注射每周2次,共4次。观察各组裸鼠肿瘤大小变化。4周后处死荷瘤鼠。免疫组织化学法检测肿瘤内VEGF表达。ELISA法测定血液及肿瘤组织中IL-12和γ-干扰素(IFN-γ)的表达。结果联合组肿瘤生长明显抑制,瘤重及体积明显小于其他组。ELISA法表明IL-12组和联合组IL-12和IFN-γ都高表达。免疫组织化学法表明联合组VEGF基因表达量明显低于其他组(P<0.05)。结论联合应用IL-12真核表达质粒pCAGGS-mIL-12和THP,对人膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制作用明显强于单独应用IL-12和THP。

关键词：膀胱癌白细胞介素-12 吡柔比星基因治疗

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pCAGGs-miR-483重组质粒构建及miR-483转基因小鼠模型的建立

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中国生物化学与分子生物学报 2010年第5期26卷 478-483页

作者：马宁王曦迪乔瑜李福源杨宝峰吕延杰单宏丽郑晓飞高旭哈尔滨医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室哈尔滨150086 哈尔滨医科大学药学院药理学教研室哈尔滨150086 北京放射与辐射医学研究所北京100850

miR-483是近年发现的一种编码于胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor2,Igf2)基因第2内含子的microRNA.研究表明,高脂饮食诱导的肥胖动物的心脏、肝脏及肝、肾肿瘤组织中miR-483表达异常,但其生物学功能尚待研究.建立稳定表达m... 详细信息

miR-483是近年发现的一种编码于胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor2,Igf2)基因第2内含子的microRNA.研究表明,高脂饮食诱导的肥胖动物的心脏、肝脏及肝、肾肿瘤组织中miR-483表达异常,但其生物学功能尚待研究.建立稳定表达miR-483并能够传代的miR-483转基因小鼠是研究其功能的重要环节.利用特异miR-483克隆引物,以小鼠基因组为模版,经PCR获得pre-miR-483片段,通过重组构建pCAGG-miR-483重组质粒.该质粒可在真核细胞中稳定表达成熟miR-483.再利用原核显微注射法建立miR-483过表达转基因小鼠.利用实时PCR检测各组织miR-483含量.结果显示,miR-483转基因小鼠心肌、骨骼肌、肝脏等组织可过表达成熟miR-483.此外,miR-483转基因过表达小鼠较野生型小鼠体重降低,提示miR-483可能在发育、代谢等方面具有调节作用.miR-483转基因小鼠模型的建立为microRNA功能研究提供了在体研究的平台.

关键词：内含子microRNA 转基因小鼠宿主基因

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中国医科大学学报 2010年第9期39卷 713-716页

作者：陈铎袁江伟宋磊魏翔泰关俊宏刘云会宗志红中国医科大学附属盛京医院神经外科沈阳110004 中国医科大学基础医学院生化教研室沈阳110001

目的通过观察大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑皮层紧密连接相关蛋白Claudin-5、ZO-1表达的变化及JNK抑制剂SP600125对其表达的影响,探讨SAH后早期脑损伤的机制。方法成年雄性SD大鼠75只,随机分成假手术组(sham组)、SAH组、SAH+DMSO组、... 详细信息

目的通过观察大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑皮层紧密连接相关蛋白Claudin-5、ZO-1表达的变化及JNK抑制剂SP600125对其表达的影响,探讨SAH后早期脑损伤的机制。方法成年雄性SD大鼠75只,随机分成假手术组(sham组)、SAH组、SAH+DMSO组、SAH+SP600125(10 mg/kg)组和SAH+SP600125(30 mg/kg)组5组。采用血管内穿刺法建立大鼠SAH模型,在SAH后24 h时,应用电镜观察各组脑皮层微血管血脑屏障形态学变化;应用Western blot检测各组中脑皮层Claudin-5、ZO-1表达的变化。结果 SAH后早期脑皮层微血管发生明显损伤改变;与sham组相比,SAH组出血后24 h Claudin-5、ZO-1的表达水平明显降低(P<0.05),c-Jun氨基端激酶(JNK)抑制剂SP600125明显改善了脑皮层微血管形态学损伤程度,并抑制了Claudin-5、ZO-1表达水平的降低。结论大鼠SAH后早期血脑屏障结构破坏是早期脑损伤关键性机制之一;SP600125可能通过抑制细胞凋亡、保护血脑屏障发挥SAH早期脑损伤的神经保护作用。

关键词：蛛网膜下腔出血早期脑损伤紧密连接相关蛋白血脑屏障大鼠

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骨髓基质干细胞移植对慢性酒精中毒大鼠认知功能的影响及其机制

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中华行为医学与脑科学杂志 2010年第2期19卷 101-103页

作者：刘蕾胡建孙博哈尔滨医科大学附属第一医院精神科哈尔滨150001 哈尔滨医科大学附属第一医院基础医学院神经生物学教研室哈尔滨150001

目的探讨骨髓基质干细胞（BMSCs）静脉移植对慢性酒精中毒大鼠认知功能的影响及其机制。方法体外分离、培养并鉴定SD大鼠BMSCs。成年雄性SD大鼠（11=28）分为对照组、慢性酒精中毒组、BMSCs回输组和PBS回输组，每组n=7。其中，BMSCs回... 详细信息

目的探讨骨髓基质干细胞（BMSCs）静脉移植对慢性酒精中毒大鼠认知功能的影响及其机制。方法体外分离、培养并鉴定SD大鼠BMSCs。成年雄性SD大鼠（11=28）分为对照组、慢性酒精中毒组、BMSCs回输组和PBS回输组，每组n=7。其中，BMSCs回输组和PBS回输组于酒精灌胃7周后经尾静脉回输BMSCs（1×10^7个细胞／只）或磷酸盐缓冲液（PBS），所有大鼠均于灌胃8周后处死。通过Morris水迷宫进行认知功能检测；BrdU免疫荧光染色观察大鼠脑内海马齿状回神经细胞的增殖情况；免疫组化染色观察大鼠海马区NGF和BDNF表达情况。结果①Morris水迷宫实验中，BMSCs回输组各时间点逃避潜伏期[（33．83±3．26）s，（13．14±2．64）s，（6．53±0．98）s，（4．45±0．85）s]明显短于慢性酒精中毒组[（53．78±4．29）s，（36．53±2．39）s，（18．28±2．13）s，（8．67±0．46）s，（P〈0．01）]；平台象限时间百分比[（73．99±1．49）％]明显长于慢性酒精中毒组[（51．25±3．69）％，（P〈0．01）]，且与对照组差异无显著性。②BMSCs回输组齿状回BrdU阳性细胞数显著多于慢性酒精中毒组（P〈0．01）。③BMSCs回输组大鼠海马NGF和BDNF表达均明显高于慢性酒精中毒组。结论首次证实静脉移植BMSCs能够明显改善慢性酒精中毒大鼠的认知功能；其认知功能改善的机制可能与自／旁分泌BDNF和NGF营养因子刺激了海马内源性神经细胞增殖有关。

关键词：骨髓基质干细胞慢性酒精中毒认知功能

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FAP在胃癌间质中的表达及其与微血管密度的关系

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国际遗传学杂志 2010年第3期33卷 134-137+146页

作者：邵洪江靳占峰哈尔滨医科大学基础医学院法医教研室

目的探讨FAP在胃癌间质中的表达及其与微血管密度（microvessel density,MVD）的关系。方法收集162例胃癌组织,同时建立人胃癌细胞系SGC-7901裸鼠皮下移植瘤模型,采用免疫组织化学染色法检测FAP和CD34的表达。结果在人胃癌组织中,FAP表... 详细信息

目的探讨FAP在胃癌间质中的表达及其与微血管密度（microvessel density,MVD）的关系。方法收集162例胃癌组织,同时建立人胃癌细胞系SGC-7901裸鼠皮下移植瘤模型,采用免疫组织化学染色法检测FAP和CD34的表达。结果在人胃癌组织中,FAP表达于间质成纤维细胞,表达阳性率为90.74%（147例）,而胃癌细胞和正常胃组织中无表达,且FAP表达和MVD分别与胃癌的分化程度（x;=51.882,P<0.0;x;=46.383,P<0.01）、侵袭深度（x;=40.193,P<0.01;x;=21.617,P<0.01）及淋巴结转移（x;=24.232,P<0.01;x;=13.393,P<0.01）有关。在15例裸鼠皮下移植瘤中,所有肿瘤中FAP均不同程度在间质成纤维细胞呈阳性表达。在人胃癌组织（x;=97.710,P<0.01）和裸鼠皮下移植瘤组织（x;=11.100,P<0.01）中,不同强度的FAP表达组间肿瘤间质MVD的差异具有统计学意义,且随着FAP表达水平的增高,MVD也随之增加。结论 FAP的表达与胃癌的分化程度、侵袭深度及淋巴结转移有关。FAP可能通过促进肿瘤的微血管生成,加快肿瘤的生长、侵袭和转移。

关键词：胃癌成纤维细胞激活蛋白肿瘤血管生成 SGC-7901细胞系裸鼠

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沉默survivin抑制喉癌细胞Hep-2生长的实验研究

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中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2010年第8期45卷 674-679页

作者：文连姬高丽芳汲坤张赫佳富东娜杨景朴徐艳萍陈国威金春顺赵雪俭吉林大学第二医院耳鼻咽喉科长春130041 吉林心脏病医院心血管内科沈阳医学院病理生理教研室齐齐哈尔医科大学生化教研室吉林大学基础医学院病理生理教研室

目的探讨沉默survivin对喉癌细胞Hep-2生长的影响.方法将重组质粒（psi-survivin）和阴性对照质粒（psi-scramble）用脂质体包裹转染人喉癌细胞株Hep-2,分别用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）从mRNA和蛋... 详细信息

目的探讨沉默survivin对喉癌细胞Hep-2生长的影响.方法将重组质粒（psi-survivin）和阴性对照质粒（psi-scramble）用脂质体包裹转染人喉癌细胞株Hep-2,分别用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）从mRNA和蛋白水平检测survivin的表达.四甲基偶氮唑蓝（MTT）观察喉癌细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡.建立裸鼠喉癌移植瘤模型,将psi-survivin和psi-scramble注射于肿瘤周围,观察其抗肿瘤的效果.免疫组化法和Western blot法检测重组质粒对肿瘤Survivin蛋白表达的影响.末端脱氧核苷酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记技术（Tunel）观察肿瘤细胞的凋亡.结果 psi-survivin不仅在mRNA水平（抑制率为54.4%）,而且蛋白水平也抑制Survivin表达,抑制率为37.0%.MTT证实psi-survivin明显抑制喉癌细胞的增殖,抑制率达71.7%.流式细胞仪结果显示psi-survivin组细胞凋亡明显增加,凋亡率达（13.05±0.56）%（（-x）±s,下同）.体内实验表明,质粒注射后第32天,盐水组瘤体积为（1443.9±230.5）mm3,psi-scramble组为（1348.5±198.4）Rim3,而psi-survivin组为（624.6±188.4）mm3,与对照组相比,差异有统计学意义（t=-5.917,P＜0.01）.psi-survivin能明显抑制肿瘤survivin的表达,抑制率为41.8%,与对照组相比,差异有统计学意义（t=-80.343,P＜0.01）.Tunel染色结果显示psi-survivin组肿瘤组织中出现较多凋亡细胞,而对照组未见凋亡细胞.结论沉默survivin能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长.

关键词：基因沉默微管相关蛋白质类喉肿瘤细胞系,肿瘤

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