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基于处方挖掘与分子动力学模拟筛选严重急性呼吸综合征冠状病毒2潜在抑制剂分子的研究

生物化学与生物物理进展 2022年第10期49卷 1889-1900页

作者：张晓铮高颖刘玉邰杨浩梁力中张玉龙侯淑琳解军山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室太原030001 山西医科大学第二临床医学院太原030001 山西医科大学第一临床医学院太原030001 中国科学院广州生物医药与健康研究院呼吸疾病国家重点实验室广州510530

目的从中药筛选具有潜在抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)活性的成分,进一步从原子水平揭示其抑制SARS-CoV-2表面刺突蛋白(S蛋白)受体结合域(RBD)与血管紧张素转化酶2(ACE2)结合的内在机制。方法检索新型冠状病毒(简称“新... 详细信息

目的从中药筛选具有潜在抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)活性的成分,进一步从原子水平揭示其抑制SARS-CoV-2表面刺突蛋白(S蛋白)受体结合域(RBD)与血管紧张素转化酶2(ACE2)结合的内在机制。方法检索新型冠状病毒(简称“新冠肺炎”)治疗中药处方,构建“新冠肺炎中药候选活性成分数据库”。用具有ACE2抑制活性的小分子化合物构建HipHop药效团模型,并对“新冠肺炎中药候选活性成分数据库”中活性成分筛选。采用分子对接和分子动力学模拟方法研究候选活性成分与ACE2的结合方式及其对SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2识别的影响。结果本文通过中药处方挖掘和分子动力学模拟,从143个新冠肺炎治疗中药处方中筛选出10种可与SARS-CoV-2 S蛋白/人源ACE2识别位点结合的中药成分。其中,枇杷叶主要活性成分23-trans-p-coumaryhormentic acid与ACE2具有最高的亲和力,且23-trans-p-coumaryhormentic acid的结合可有效阻断SARS-CoV-2 S蛋白与宿主细胞ACE2的结合。结论本文通过虚拟筛选发现了SARS-CoV-2潜在抑制剂分子23-trans-p-coumaryhormentic acid,同时从原子水平预测了其抑制SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2结合的内在机制,这将为SARS-CoV-2特异性抗病毒药物的研发提供理论依据。

关键词：严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2抑制剂中药处方数据挖掘分子对接分子动力学模拟

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二甲双胍对肾癌细胞凋亡的影响及机制

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南方医科大学学报 2011年第9期31卷 1504-1508页

作者：李明刘俊胡卫列贾春宏李海燕温芝华邹志鹏白晓春罗深秋南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室广东广州510515 广州军区广州总医院泌尿外科广东广州510010

目的探讨二甲双胍对肾癌细胞凋亡的影响及其机制。方法通过Annexin V-FITC/PI染色镜下观察及流式细胞仪检测观察二甲双胍对786-O细胞凋亡的影响,通过免疫印迹检测AMPK信号及Caspase 9表达探讨可能分子机制。结果二甲双胍能够诱导786-O... 详细信息

目的探讨二甲双胍对肾癌细胞凋亡的影响及其机制。方法通过Annexin V-FITC/PI染色镜下观察及流式细胞仪检测观察二甲双胍对786-O细胞凋亡的影响,通过免疫印迹检测AMPK信号及Caspase 9表达探讨可能分子机制。结果二甲双胍能够诱导786-O在低浓度血清环境凋亡,激活Caspase 9,二甲双胍能够激活786-O细胞中AMPK信号,但与其凋亡诱导效应无关。结论二甲双胍能够诱导肾癌细胞在低浓度血清环境凋亡,具有潜在治疗肾癌作用。

关键词：二甲双胍肾细胞癌细胞增殖细胞凋亡 AMPK

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曲古菌素A在胃腺癌细胞系SGC-7901中的作用

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中华胃肠外科杂志 2007年第4期10卷 376-379页

作者：李云龙邹小明郭宝良李晓林闫朝岐尤立光傅松滨哈尔滨医科大学附属第二医院普通外科 150086 哈尔滨医科大学附属第五医院普通外科哈尔滨医科大学附属第二医院基础医学院医学遗传学与生物学教研室 150086

目的研究曲古菌素A（TSA）在胃腺癌细胞系SGC-7901中的作用。方法四甲基偶氮唑蓝法测定TSA对SGC-7901的细胞毒性，荧光显微镜观察细胞核DNA的变化，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，Western印迹检测组蛋白H3的乙酰化状态。结果SGC-790... 详细信息

目的研究曲古菌素A（TSA）在胃腺癌细胞系SGC-7901中的作用。方法四甲基偶氮唑蓝法测定TSA对SGC-7901的细胞毒性，荧光显微镜观察细胞核DNA的变化，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，Western印迹检测组蛋白H3的乙酰化状态。结果SGC-7901细胞生长曲线表明，TSA浓度增高，细胞生长率下降。细胞凋亡率在75ng／mlTSA作用72h时与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。凋亡细胞DNA变化主要表现为核染色质固缩及断裂，荧光染色增强。流式细胞仪分析出现明显的亚G1期峰，G1期细胞减少，细胞凋亡率达29．54％。TSA作用后，乙酰化的组蛋白如明显增多。结论TSA可以诱导SGC-7901细胞发生凋亡，组蛋白H3的乙酰化状态可能与细胞凋亡有关。

关键词：胃肿瘤曲古菌素A 细胞凋亡乙酰化组蛋白H3 细胞系SGC-7901

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感染Vero细胞中SARS病原体的电镜观察

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上海第二医科大学学报 2004年第3期24卷 192-194页

作者：朱平陈洪陈新宇陈淑云杨洁张岚易静刘晶星上海第二医科大学基础医学院细胞生物学教研室上海200025 上海第二医科大学基础医学院病原生物学教研室上海200025

目的用透射电子显微镜(TEM)观察严重急性呼吸综合征(SARS)患者感染的Vero细胞,为SARS病原体的分离鉴定提供形态学资料。方法标本为上海市疾病控制中心送检的SARS患者鼻咽拭子接种感染的Vero细胞,对培养液负染色标本和Vero细胞超薄切... 详细信息

目的用透射电子显微镜(TEM)观察严重急性呼吸综合征(SARS)患者感染的Vero细胞,为SARS病原体的分离鉴定提供形态学资料。方法标本为上海市疾病控制中心送检的SARS患者鼻咽拭子接种感染的Vero细胞,对培养液负染色标本和Vero细胞超薄切片标本进行TEM观察。结果在负染色标本和超薄切片标本中均可观察到病毒,病毒颗粒为圆形或椭圆形,外周有冠状排列的纤突,病毒颗粒直径约80～160 nm,纤突长度约20～40 nm。感染细胞的病毒颗粒分布在细胞质中,主要在内质网和空泡内,可见群集的大小较一致的病毒颗粒。结论本例电镜所见病毒颗粒大小、形态与文献报道的SARS冠状病毒(SARS-CoV)相符。

关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒电子显微镜 Vero细胞病原体细胞形态学

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腺病毒介导人ATF6基因修饰对体外细胞增殖凋亡的实验研究

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重庆医科大学学报 2015年第10期40卷 1338-1343页

作者：韩晓凤李美玲夏飞张鹏郭风劲重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室/发育生物学与模式动物平台重庆400016

目的:构建携带人活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)的重组腺病毒Ad-ATF6和Ad-ATF6 si RNA,并探讨内质网应激(ER Stress,ERS)时其对人软骨肉瘤细胞SW1353增殖凋亡的影响。方法:将ATF6基因序列与靶向ATF6的si RNA序列分别克隆到p Ad Track-cmv和p SES-HUS穿梭质粒上,然后分别与腺病毒骨架质粒p Ad Easy-1在大肠杆菌BJ5183感受态中同源重组,得到腺病毒重组质粒p Ad-ATF6和p Ad-ATF6 si RNA,通过脂质体介导在HEK293细胞中进行包装和扩增。通过RT-PCR和Western blot检测病毒效果。流式细胞仪法(flow cytometry,FCM)、MTT法及Western blot检测ERS状态下ATF6对SW1353细胞增殖凋亡的影响。结果:成功获得了重组腺病毒Ad-ATF6和Ad-ATF6 si RNA。RT-PCR和Western blot结果表明,重组腺病毒能有效的感染细胞。FCM检测结果表明,ERS条件下,ATF6感染组S期细胞比例明显升高,凋亡率明显降低(P=0.000);Ad-ATF6 si RNA感染组S期细胞比例明显降低,凋亡率明显上升(P=0.000)。MTT与Western blot实验结果与FCM结果一致。结论:ERS状态下,ATF6能促进SW1353细胞的增殖,抑制其凋亡。

关键词：活化转录因子6 重组腺病毒 SW1353细胞增殖和凋亡

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RI基因真核表达载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞的影响

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第三军医大学学报 2012年第16期34卷 1591-1595页

作者：李红彦潘湘阳姚雪熊东梅陈俊霞重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的构建融合表达载体pcDNA3.1-RI,并检测核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因与血管生成素(angiogenin,ANG)的关系及对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖及迁移能力的影响。方法用RT-PCR方法扩增RI基因,酶切后将其插入pcDNA3.1,构建融合表达载体pcDNA3.1-RI,在脂质体介导下转染HUVECs,RT-PCR检测RI、ANG基因的mRNA表达水平;Western blot检测RI、ANG、MMP-2、MMP-9的表达水平;CO-IP法检测ANG和RI的相互作用,MTT法检测细胞的增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果真核表达质粒构建成功;转染pcDNA3.1-RI组细胞RI基因的mRNA及蛋白的表达较2个对照组(转染pcDNA3.1空载体组和未转染质粒组)均呈显著性增加(P<0.05),而ANG基因的mRNA及蛋白的表达均降低(P<0.05),MMP-2、MMP-9蛋白表达水平亦降低(P<0.05);CO-IP法检测到ANG和RI在细胞内能结合;转染pcDNA3.1-RI质粒到HUVECs细胞后细胞的增殖活力明显降低(P<0.05),G0～G1期比例明显增加,S期减少。结论成功构建的真核表达质粒能显著增加RI基因及其蛋白水平的表达,RI可以直接在转录水平上降低ANG的表达,在细胞内与ANG结合,从而影响内皮细胞的增殖、迁移能力。

关键词：核糖核酸酶抑制因子人脐静脉内皮细胞血管生成素真核表达

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血管紧张素Ⅱ对动脉粥样硬化斑块炎症的影响

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上海第二医科大学学报 2005年第1期25卷 47-49页

作者：董波颜兆文陈玉英李惠丽黄定九山东省立医院心内科济南250021 上海第二医科大学基础医学院病理学教研室上海第二医科大学基础医学院细胞生物教研室上海第二医科大学仁济医院心内科

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AⅡ)对动脉粥样硬化(AS)斑块炎症及稳定性的影响。方法新西兰兔12只,随机分为单纯高脂组(注射生理盐水)和AⅡ组(注射AⅡ)各6例,喂养3个月。采用计算机图象分析系统测定内膜、中膜的厚度和面积,免疫组化法检测血管... 详细信息

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AⅡ)对动脉粥样硬化(AS)斑块炎症及稳定性的影响。方法新西兰兔12只,随机分为单纯高脂组(注射生理盐水)和AⅡ组(注射AⅡ)各6例,喂养3个月。采用计算机图象分析系统测定内膜、中膜的厚度和面积,免疫组化法检测血管壁巨噬细胞表达。结果AⅡ组内膜、中膜的厚度和面积明显高于单纯高脂组水平(P<0.05);AⅡ组AS斑块内含有大量巨噬细胞和巨噬细胞源性泡沫细胞,而单纯高脂饮食组AS斑块内只有稀疏分布的巨噬细胞和巨噬细胞源性泡沫细胞。结论注射AⅡ能明显促进高脂饮食兔AS斑块的炎症程度,加重其病理过程。

关键词：动脉粥样硬化炎症血管紧张素Ⅱ 免疫组化法

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FZS中药合剂对细胞凋亡的保护作用研究

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哈尔滨医科大学学报 2009年第4期43卷 320-324页

作者：王建秀王德生段淑荣赵敬堃郭彩玲张凤民哈尔滨医科大学第一临床医学院神经内科黑龙江哈尔滨150001 哈尔滨医科大学基础医学院微生物学教研室黑龙江哈尔滨150081

目的探讨FZS中药合剂对Aβ25-35、Aβ42、Aβ42寡聚体诱导的PC12细胞凋亡的保护作用。方法应用正常细胞进行对照研究,通过测定MTT、LDH和原位末端标记(TUNEL)方法检测细胞凋亡。原子力显微镜观察PC12细胞表面突起的变化。结果MTT在FZS... 详细信息

目的探讨FZS中药合剂对Aβ25-35、Aβ42、Aβ42寡聚体诱导的PC12细胞凋亡的保护作用。方法应用正常细胞进行对照研究,通过测定MTT、LDH和原位末端标记(TUNEL)方法检测细胞凋亡。原子力显微镜观察PC12细胞表面突起的变化。结果MTT在FZS组明显增高(P<0.05);LDH、TUNEL凋亡率在FZS组表达明显降低(P<0.05);原子力显微镜观察Aβ致细胞表面突起缩短的现象在FZS组明显改善,差异有显著意义(P<0.05)。结论FZS可以通过降低Aβ的细胞凋亡作用而减少其细胞毒性,FZS中药合剂可能成为Alzheimer病的治疗手段之一。

关键词： β-淀粉样蛋白寡聚体凋亡中药合剂原子力显微镜

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GST／RIPX融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

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中国医科大学学报 2010年第12期39卷 987-988,994页

作者：王孝会王桂玲中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳110001

目的构建GST/RIPX融合蛋白基因表达载体,并在大肠埃希菌(***)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-RIPX为模板,通过BamH1和Xho1酶切位点将RIPX定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并转化*** DH5α,筛选阳性重组子,限制性... 详细信息

目的构建GST/RIPX融合蛋白基因表达载体,并在大肠埃希菌(***)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-RIPX为模板,通过BamH1和Xho1酶切位点将RIPX定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并转化*** DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入化*** BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并用SDS-PAGE方法证实了GST/RIPX融合蛋白的表达。结论成功构建了RIPX原核表达载体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化RIPX蛋白和研究RIPX的生物学功能奠定了基础。

关键词：质粒原核表达融合蛋白 RIPX

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利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术在悬浮细胞中获得基因沉默效应

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基础医学与临床 2012年第2期32卷 226-232页

作者：王淳方文刚李波辽宁中医药大学基础医学院卫生生物教研室辽宁沈阳110032 中国医科大学基础医学院发育生物教研室卫生部细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001

目的利用重组腺病毒载体携带短发夹RNA(shRNA),使难于转染的悬浮细胞达到较高的目的基因沉默效率。方法分别将含有人胎盘生长因子(PLGF)的干扰序列及阴性对照序列(scramble)连入pRNAT-H1.1/Adeno载体,获得重组穿梭质粒;将线性化的重组... 详细信息

目的利用重组腺病毒载体携带短发夹RNA(shRNA),使难于转染的悬浮细胞达到较高的目的基因沉默效率。方法分别将含有人胎盘生长因子(PLGF)的干扰序列及阴性对照序列(scramble)连入pRNAT-H1.1/Adeno载体,获得重组穿梭质粒;将线性化的重组穿梭质粒与腺病毒骨架重组;将重组子转染HEK 293细胞,经过3轮病毒包装,收获病毒颗粒并测定滴度。病毒颗粒感染悬浮细胞——人小细胞肺癌细胞(NCI-H 250和NCI-H 209),通过实时定量PCR方法鉴定靶基因沉默效应,并利用肿瘤细胞重建基质膜侵袭实验进行功能鉴定。结果成功构建带有靶基因干扰序列及scramble、空载体的3种腺病毒重组子(AD-shuttle-shPLGF、AD-shuttle-scramble和AD-shuttle)。经过HEK 293细胞包装,最终获得3株病毒颗粒,病毒滴度分别为1.5×1011、1.6×1011和1.6×1011。NCI-H 250和NCI-H 209细胞感染腺病毒颗粒48 h后,大部分细胞表达GFP,感染率接近100%;且两株细胞感染AD-shuttle-shPLGF病毒48 h后,PLGF mRNA表达水平降低(P<0.01),肿瘤细胞侵袭能力明显下降(P<0.01)。结论携带shRNA的腺病毒表达载体可以代替电转、脂质体介导等方法,使难于转染细胞的目的基因达到有效沉默。

关键词： RNA干扰 shRNA 腺病毒载体悬浮细胞

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