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中国医科大学学报 2012年第10期41卷 870-872,876页

作者：高建郑倩倩李彦姝周末中国医科大学实验技术中心三部沈阳110001 中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室沈阳110001

目的通过激光共聚焦技术,观察SGC-7901胃癌细胞系在不同固定液作用下的细胞骨架及连接蛋白荧光染色。方法接种SGC-7901细胞24 h后,分别用4%多聚甲醛、2.5%戊二醛及95%乙醇室温固定20 min,5%BSA(含0.2%Triton X-100)封闭透膜1 h,直标荧... 详细信息

目的通过激光共聚焦技术,观察SGC-7901胃癌细胞系在不同固定液作用下的细胞骨架及连接蛋白荧光染色。方法接种SGC-7901细胞24 h后,分别用4%多聚甲醛、2.5%戊二醛及95%乙醇室温固定20 min,5%BSA(含0.2%Triton X-100)封闭透膜1 h,直标荧光一抗避光37℃孵育1 h,DAPI室温染核15 min,激光共聚焦扫描显微镜扫描。结果 4%多聚甲醛对细胞骨架微丝结构及连接蛋白Zo-1细胞膜定位均有较好的固定作用,2.5%戊二醛对微丝结构基本起到固定作用,而95%乙醇对于微丝的固定效果略差。后两种固定液固定细胞均出现连接蛋白胞质表达的非特异染色现象。结论 4%多聚甲醛对细胞骨架及细胞间连接蛋白的固定效果较优,荧光染色标记结果为后续研究提供依据。

关键词：固定液细胞骨架连接蛋白激光共聚焦

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骨肉瘤细胞中ArgBP2的表达和定位

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细胞与分子免疫学杂志 2012年第3期28卷 237-239页

作者：沈涛李妍杨礼庆梁爽巴根付勤中国医科大学附属盛京医院骨科辽宁沈阳110004 中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室细胞生物学卫生部重点实验室辽宁沈阳110001 明尼苏达大学实验病理系美国艾波利斯55455

目的:构建真核表达载体GFP-hArgBP2并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位。方法:以pcDNA3.1-hArgBP2为模板,利用PCR扩增hArgBP2基因cDNA全长,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-C1中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉... 详细信息

目的:构建真核表达载体GFP-hArgBP2并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位。方法:以pcDNA3.1-hArgBP2为模板,利用PCR扩增hArgBP2基因cDNA全长,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-C1中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉瘤细胞MG-63中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察GFP-hArgBP2在MG-63细胞中的定位,免疫沉淀的方法纯化hArgBP2蛋白。结果:hArgBP2基因cDNA全长成功构建到真核表达载体pEGFP-C1中,Western blot检测到了GFP-hArgBP2融合蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为97 000。GFP-hArgBP2在骨肉瘤细胞MG-63中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化hArgBP2蛋白。结论:成功地构建了GFP-hArgBP2真核表达质粒,同时鉴定了GFP-hArgBP2融合蛋白的表达,并纯化hArgBP2蛋白。GFP-hArgBP2蛋白主要定位在细胞质和核周。

关键词： ArgBP2 Western blot 免疫沉淀

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一个中国汉族皮肤和粘膜多发静脉血管畸形家系的单倍型分析

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遗传 2012年第4期34卷 431-436页

作者：舒伟林有坤华荣罗彦彦方玲许淑茹何娜马军胡启平李晓龙袁志刚广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁530021 广西医科大学第一附属医院皮肤科南宁530021 广西自治区计划生育科研中心南宁530021

根据患者的临床体征以及家系的遗传方式,文章对一个中国汉族皮肤和粘膜多发静脉血管畸形(Mucocutaneous venous malformations,VMCM)家系进行了临床诊断。家系中连续5代都有患者,男女患者比例约1:1,为常染色体显性遗传方式。患者皮肤、... 详细信息

根据患者的临床体征以及家系的遗传方式,文章对一个中国汉族皮肤和粘膜多发静脉血管畸形(Mucocutaneous venous malformations,VMCM)家系进行了临床诊断。家系中连续5代都有患者,男女患者比例约1:1,为常染色体显性遗传方式。患者皮肤、口腔粘膜、舌头以及四肢等处可见蓝紫色、突出皮面、质硬、压之不褪色的瘤体,组织病理学显示,静脉血管的管腔极不规则,部分管壁存在缺失,部分管壁明显增厚。患者无消化道出血史,无心脏和脑部异常,临床诊断为VMCM。为了进行致病基因的定位和单倍型分析,采集了家族中26人的外周血并提取基因组DNA,并设计微卫星引物进行了连锁和单倍型分析。两点间连锁分析的结果表明,在D9S1121处有最大LOD值为Z=5.38(θ=0.00),单倍型分析的结果提示,致病基因定位于9号染色体短臂上D9S1121和D9S161之间约7 cM的范围内。文章首次报道了中国汉族VMCM家系,其致病基因定位定位于9p,与已报道的欧洲家系相同。用4个微卫星标记D9S1121、D9S 169、D9S161和D9S248确定了该家系致病基因的单倍型,为不同种族和人群VMCM疾病相关研究提供参考。

关键词：血管畸形皮肤和粘膜多发静脉血管畸形(VMCM) 汉族单倍型

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JNK在小鼠毛囊周期中的动态表达

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第三军医大学学报 2012年第22期34卷 2274-2277页

作者：王瑞敏星懿展郭海英何龙杨恬连小华查何彭惠民重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 第三军医大学基础医学部细胞生物学教研室重庆400038 重庆大学生物工程学院重庆400030

目的研究JNK在生后小鼠背皮毛囊周期中的表达规律及探讨其对毛囊周期的调控作用。方法选择生后不同时期(1、7、14、16、21、31 d)C57BL/6J小鼠54只,采用RT-PCR技术,检测JNK mRNA在小鼠背皮毛囊周期中的表达情况;采用Western blot和免疫... 详细信息

目的研究JNK在生后小鼠背皮毛囊周期中的表达规律及探讨其对毛囊周期的调控作用。方法选择生后不同时期(1、7、14、16、21、31 d)C57BL/6J小鼠54只,采用RT-PCR技术,检测JNK mRNA在小鼠背皮毛囊周期中的表达情况;采用Western blot和免疫组化技术,进一步检测JNK蛋白在毛囊周期中的表达规律。结果 RT-PCR检测结果表明,在毛囊周期中,JNK1在生长早期(生后7、31 d)表达最强,退化期(生后16 d)和静止期(生后21 d)维持较弱的表达;JNK2在各时相点均有中等强度表达。单因素方差分析显示,JNK1的表达水平在生长早期(0.99±0.02)与静止期(0.30±0.01)间存在显著差异(P<0.05),JNK2在生长早期(0.77±0.01)与退化期(0.97±0.03)间存在显著差异(P<0.05)。Western blot与RT-PCR检测结果一致。免疫组化结果显示,在毛囊生长期,JNK主要表达于毛母质和外根鞘;进入退化期,JNK表达于外根鞘和上皮索;静止期毛囊中无表达。结论 JNK在毛囊周期中呈动态表达模式,生长期JNK可能通过影响毛母质细胞的增殖和/或分化来调节毛囊生长;退化期JNK可能涉及毛囊细胞的凋亡过程。

关键词： JNK 毛囊毛囊周期小鼠表达

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Rheb和Rheb＇D60K突变基因重组慢病毒载体的构建、鉴定及其对肝癌细胞凋亡的影响

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南方医科大学学报 2012年第3期32卷 341-344,348页

作者：陈可和梁博邹镇洪韩泽龙潘金飞刘安玲广西壮族自治区人民医院临床肿瘤中心广西南宁530021 南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室广东广州510515

目的构建携带Rheb和Rheb'D60K突变基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在MCF-7细胞中的表达效果,观察其对肝癌细胞凋亡的影响。方法 PCR法扩增Rheb和Rheb'D60K突变基因,构建重组质粒LV31-Rheb-WT、LV31-Rheb-D60K,脂质体法将重组慢... 详细信息

目的构建携带Rheb和Rheb'D60K突变基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在MCF-7细胞中的表达效果,观察其对肝癌细胞凋亡的影响。方法 PCR法扩增Rheb和Rheb'D60K突变基因,构建重组质粒LV31-Rheb-WT、LV31-Rheb-D60K,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染HEK-293 FT细胞,包装产生慢病毒颗粒。将病毒感染MCF-7细胞后Western blotting检测Rheb及PS6蛋白的表达;将病毒感染SK-HEP-1细胞饥饿处理后观察其凋亡情况。结果 PCR及测序表明成功构建了LV31-Rheb-WT、LV31-Rheb-D60K重组慢病毒载体。Western blotting结果显示慢病毒LV31-Rheb-WT感染的MCF-7细胞内Rheb下游的PS6蛋白表达多于慢病毒LV31-Rheb-D60K感染的MCF-7细胞。显微镜下慢病毒LV31-Rheb-D60K感染的SK-HEP-1细胞饥饿后凋亡数目多于慢病毒LV31-Rheb-WT感染的SK-HEP-1细胞。结论本研究成功构建了Rheb和Rheb'D60K突变基因重组慢病毒载体,初步观察到该突变基因重组慢病毒载体可诱导肝癌细胞凋亡,为进一步研究Rheb基因在肝癌发生发展中的作用,进而开展肝癌的临床靶向治疗研究奠定了基础。

关键词： Rheb 慢病毒载体 MCF-7细胞株乳腺癌 SK-HEP-1细胞株肝细胞癌

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Flag标签MORC2-677丝氨酸位点突变载体构建及表达

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生命科学研究 2012年第1期16卷 1-5页

作者：王桂玲王孝会程正国宋艳艳李丰中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室教育部细胞生物学重点实验室中国辽宁沈阳110001

构建Flag标签pcDNA3.1-MORC2的677丝氨酸位点突变重组质粒并完成在SGC-7901细胞中表达,更好地研究677丝氨酸位点所发生的功能.首先,构建含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点Flag标签的pcDNA3.1空载体;再以含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点的pcDNA3.1A-MOR... 详细信息

构建Flag标签pcDNA3.1-MORC2的677丝氨酸位点突变重组质粒并完成在SGC-7901细胞中表达,更好地研究677丝氨酸位点所发生的功能.首先,构建含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点Flag标签的pcDNA3.1空载体;再以含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点的pcDNA3.1A-MORC2-WT野生型质粒为模板,在S677突变位点两侧设计重叠突变引物,进行三轮重叠延伸PCR完成定点突变,获得MORC2全长编码序列的S677位点的定点突变体载体(pcDNA3.1A-MORC2-S677A/S677E);再通过KpnⅠ和XhoⅠ酶切把pcDNA3.1A-MORC2-WT/S677A/S677E各载体定向克隆到已构建好的pcDNA3.1-Flag空载体中,酶切鉴定及测序正确后,转染到SGC-7901细胞中,利用Flag–标签抗体,Western blot检测其各突变载体的表达.成功构建了人Flag标签MORC2全长编码序列S677位点突变体真核表达载体并在SGC-7901细胞中获得带Flag标签融合蛋白表达产物,为进一步研究MORC2的功能奠定了基础.

关键词： MORC2 突变体真核表达载体基因表达胃癌细胞

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骨髓间充质干细胞对致脑脊髓炎性MBP68-86特异性T淋巴细胞的调节作用

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国际免疫学杂志 2012年第6期35卷 474-477页

作者：杨琳丽王广友詹晓霞刘宇王心悦孙博李呼伦哈尔滨医科大学基础医学院神经生物学教研室 150086

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）对致脑脊髓炎性MBP68-86特异性T淋巴细胞的抑制和激活作用。方法全骨髓贴壁法提取、培养Lewis大鼠股骨、胫骨内的MSCs；建立实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）动物模型，对照组大鼠仅免疫完全弗氏佐剂（... 详细信息

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）对致脑脊髓炎性MBP68-86特异性T淋巴细胞的抑制和激活作用。方法全骨髓贴壁法提取、培养Lewis大鼠股骨、胫骨内的MSCs；建立实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）动物模型，对照组大鼠仅免疫完全弗氏佐剂（CFA）；EAE大鼠免疫10—11d后，MBP68-86特异性T淋巴细胞被取出进行体外T淋巴细胞增值试验。从Lewis大鼠中得到的间质干细胞分别按下列要求预培养：在24孔板中与T细胞比值：1：1（1×10^6骨髓基质细胞／T细胞1×10^6）1：5、1：10、1：50或1：100；ELISA方法检测淋巴细胞培养上清液。结果同种同基因的MSCs以MSCs与效应T细胞比例为1：1、1：5、1：10时共培养能够显著抑制MBP68-86特异性T淋巴细胞的增殖能力，与没有加入MSCs的单独MBP68-86特异性T淋巴细胞组相比差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论MSCs在高密度（MSCs／T细胞数比≥1：10）的情况下，对MBP68-86一特异性T细胞表现为抑制作用；在较低的密度（≤1：50）时，表现为刺激的作用。

关键词：骨髓间充质干细胞实验性自身免疫性脑脊髓炎 MBP68-86特异性T淋巴细胞免疫调节

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绒毛外滋养层细胞的功能及其内分泌调节机制

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中国生育健康杂志 2012年第5期23卷 399-400,F0003页

作者：徐杰吕春梅朱辉哈尔滨医科大学基础医学院生理学教研室 150081

妊娠是一个复杂而精细的过程。在妊娠早期囊胚着床之后，胎盘绒毛外滋养层细胞（extravillous trophoblast，EVT）向子宫蜕膜层和肌层血管进一步侵袭、迁移、分化，启动并完成血管重塑，是建立母．胎循环的关键环节。因此EVT细胞的迁移... 详细信息

妊娠是一个复杂而精细的过程。在妊娠早期囊胚着床之后，胎盘绒毛外滋养层细胞（extravillous trophoblast，EVT）向子宫蜕膜层和肌层血管进一步侵袭、迁移、分化，启动并完成血管重塑，是建立母．胎循环的关键环节。因此EVT细胞的迁移和侵袭功能是保证血管重塑和妊娠顺利完成的基本要素。而EVT细胞的增值、迁移和侵袭功能受到体内微环境因素，如胎盘细胞分泌的人绒毛膜促性腺激素、孕酮、雌二醇和瘦素等的精细调节。EVT细胞侵袭性迁移不足，可导致子宫螺旋动脉重塑不足，与流产、先兆子痫等妊娠相关疾病密切相关。因此，明确EVT细胞侵袭性迁移的调节机制将为预防与治疗上述疾病提供莺要依据。本文就EVT细胞的功能及其内分泌调节机制加以综林。

关键词：绒毛外滋养层细胞人绒毛膜促性腺激素孕酮雌二醇瘦素

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siRNA沉默整合素连接激酶对人膀胱癌细胞凋亡的影响

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第三军医大学学报 2012年第21期34卷 2154-2157页

作者：高娟康炜陈俊霞朱军潘湘阳西安医学院附属医院检验科西安710077 重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆2400016

目的探讨应用整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)特异性siRNA沉默ILK基因的表达对人膀胱癌细胞凋亡的影响。方法将构建好的针对ILK基因的1个特异性siRNA表达质粒和1个无同源性的阴性对照质粒,在脂质体介导下稳定转染人膀胱癌BI... 详细信息

目的探讨应用整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)特异性siRNA沉默ILK基因的表达对人膀胱癌细胞凋亡的影响。方法将构建好的针对ILK基因的1个特异性siRNA表达质粒和1个无同源性的阴性对照质粒,在脂质体介导下稳定转染人膀胱癌BIU-87细胞,并将实验分为BIU-87 si ILK、BIU-87 vector及BIU-87细胞3组,运用TUNEL凋亡检测试剂盒和流式细胞术检测BIU-87细胞的凋亡,进一步运用Western blot检测siRNA ILK对凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2的影响。结果 TUNEL检测结果显示,BIU-87 si ILK组出现大量凋亡细胞,而BIU-87细胞组和BIU-87 vector组仅有少量凋亡细胞出现。流式细胞仪检测结果显示,BIU-87 si ILK组细胞大约有(75.70±2.00)%的凋亡细胞,而BIU-87 vector组和BIU-87细胞组仅有(0.88±0.10)%和(1.66±0.90)%的凋亡细胞,Western blot结果显示,在BIU-87 si ILK组中,Bcl-2的表达明显降低(P<0.05),而Bax和Caspase-3的表达明显升高(P<0.01)。结论 siRNA ILK可能通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达诱导膀胱癌BIU-87细胞凋亡的发生。

关键词：整合素连接激酶膀胱癌凋亡

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乳腺癌前病变组织原代成纤维细胞生物学特征初步研究

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第三军医大学学报 2012年第1期34卷 16-19页

作者：孙艳彭琼乐王黎阳赵浏阳袁泉李俊柳满然重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室 400016 基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016

目的比较乳腺导管不典型增生成纤维细胞(atypical intraductal hyperplasia fibroblasts,AFs)与正常乳腺成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)、乳腺癌肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)在生物学特征上的差异。方法采用Ⅰ型胶原酶法分离并培养AFs、NFs和CAFs,免疫细胞荧光化学检测其粘连蛋白(fibronectin,FN)表达以鉴定细胞纯度。比较3种细胞的细胞生长曲线、细胞周期和周期蛋白cyclin D1、p21waf1及p53的变化。结果获得并鉴定了NFs、AFs、CAFs;其生长速度依次增加(P<0.05),细胞周期S期百分比(8.24±2.47)、(16.94±4.77)、(33.31±7.90)依次增大(P<0.05);与NFs相比,AFs周期蛋白cyclin D1表达增加(P<0.05),p21waf1和p53蛋白表达降低(P<0.05);与CAFs相比,AFs的周期蛋白cyclin D1没有升高(P<0.05),p21waf1蛋白和p53蛋白表达更强(P<0.05)。结论 AFs相对于NFs和CAFs,细胞生长增殖具有特异性,这种变化提示乳腺肿瘤的癌前病变阶段AFs可能是NFs逐步向CAFs转变的过渡阶段。

关键词：乳腺癌微环境成纤维细胞细胞周期

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