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I型人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白120V4区氨基酸位点突变对感染细胞能力的影响

中国地方病学杂志 2012年第4期31卷 401-404页

作者：张唯哲李妍王甲业杨丹王璐晶凌虹哈尔滨医科大学微生物学和寄生虫学教研室、黑龙江省感染与免疫重点实验室、黑龙江省教育厅病原生物学重点实验室 150081 哈尔滨医科大学法医学教研室 150081 哈尔滨医科大学生物化学教研室 150081

目的探讨I型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）包膜糖蛋白120V4区氨基酸位点发生突变对CCR5及CXCR4嗜性毒株感染靶细胞能力的影响。方法根据ADA株为CCR5嗜性毒株，只具有感染CCR5细胞的能力；HXB2株为CXCR4嗜性毒株，只具有感染CXCR4细胞的能... 详细信息

目的探讨I型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）包膜糖蛋白120V4区氨基酸位点发生突变对CCR5及CXCR4嗜性毒株感染靶细胞能力的影响。方法根据ADA株为CCR5嗜性毒株，只具有感染CCR5细胞的能力；HXB2株为CXCR4嗜性毒株，只具有感染CXCR4细胞的能力，通过重叠延伸剪接的方法，构建CCR5嗜性及CXCR4嗜性毒株V4区丙氨酸替换突变体。将突变体表达载体与带有荧光报告基因的HIV骨架基因表达载体共同转染真核细胞，制备假病毒颗粒。采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测假病毒中HIV-1P24抗原，对假病毒进行定量。将假病毒按20、40ng感染***5和***4细胞，以野生株ADA和HXB2毒株为对照，通过荧光素酶（RLU）测定，检测HIV-1V4区氨基酸386—417位点各突变体假病毒对细胞的感染能力。结果成功构建HIV-1ADA和HXB2株V4区丙氨酸替换突变体，各获得10株突变体。在ADA株和HXB2株，389—391及414—417位点均发生丙氨酸替换突变体，无论是用20ng，还是40ng假病毒感染，对CCR5及CXCR4细胞的感染能力均完全丧失[（0±0）％]；在ADA株，400-403和408--410位点发生丙氨酸替换突变体，当假病毒在20ng时，感染细胞的能力达到了（124±35）％和（182±29）％；在40ng时，感染能力达到了（127±8）％和（134±16）％；在HXB2株，395—397位点发生丙氨酸替换突变体，当假病毒在20ng时，感染能力达到了（144±42）％；在40ng时，感染能力达到了（121±18）％；两株在其他位点发生丙氨酸替换突变体，但仅保留部分感染细胞能力（15％-84％）。结论HIV—1包膜糖蛋白V4区389—391及414—417位点氨基酸发生丙氨酸突变．使病毒完全丧失感染靶细胞能力。

关键词： I型人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白点突变感染

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表达红色荧光蛋白重组柯萨奇病毒B组3型基因组稳定性分析

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微生物与感染 2012年第1期7卷 28-36页

作者：赵文然钟学宽张淑娟沃晓嫚张中海王博钟照华哈尔滨医科大学细胞生物学教研室哈尔滨150086 哈尔滨医科大学地方病防治研究中心哈尔滨150086 哈尔滨医科大学微生物学教研室哈尔滨150086

本文旨在分析含红色荧光蛋白mCherry基因的重组柯萨奇病毒B组3型(CVB3)基因组的稳定性。用重组质粒pCVB3-mCherry转染HeLa细胞,观察细胞病变和mCherry的表达。收获病毒后,用噬斑形成实验纯化病毒并测定病毒毒力。将重组病毒CVB3-mCherry... 详细信息

本文旨在分析含红色荧光蛋白mCherry基因的重组柯萨奇病毒B组3型(CVB3)基因组的稳定性。用重组质粒pCVB3-mCherry转染HeLa细胞,观察细胞病变和mCherry的表达。收获病毒后,用噬斑形成实验纯化病毒并测定病毒毒力。将重组病毒CVB3-mCherry在HeLa细胞中连续传代,提取第2～6代重组病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出报告基因mCherry及CVB3部分序列,进行测序分析。结果表明,pCVB3-mCherry转染的HeLa细胞出现细胞病变并表达红色荧光蛋白mCherry;从第2代开始,CVB3-mCherry出现报告基因mCherry及部分CVBVP4基因序列丢失,基因序列丢失导致病毒开放读码框架移位。本研究表明,mCherry基因序列的插入导致CVB3基因组不稳定。随着病毒的传代逐渐丢失插入的报告基因mCherry及CVB3基因组的部分序列,病毒读码框架移位,产生致死性突变株。因此,应用CVB3-mCherry时,病毒的传代次数不超过2代,否则应重新从重组质粒中收获病毒,并对每代重组病毒进行纯化和毒力测定。

关键词：柯萨奇病毒B组3型红色荧光蛋白 mCherry 基因重组

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CMV与T7启动子对仙台病毒微小基因组拯救效率的比较

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病毒学报 2012年第3期28卷 237-245页

作者：魏国超田文洪王刚柳云帆尉迟捷董小岩凌虹吴小兵哈尔滨医科大学微生物学教研室哈尔滨150081 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052 吉林大学生命科学学院长春130012 北京五加和分子医学研究所北京100176

构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率。首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader... 详细信息

构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率。首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader序列以及丁型肝炎病毒核酶序列,插入含有CMV和T7双启动子的质粒pVAX1中,获得仙台微小基因组的通用型载体pVAX-miniSeV。将Gluc基因插入pVAX-miniSeV中,分别获得正向插入的仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV-Gluc(+)和反向插入的pVAX-miniSeV-Gluc(-)。用pVAX-miniSeV-Gluc(+)转染BHK21细胞能在上清中检测到高水平的Gluc活性,表明其中的CMV启动子具有正常转录功能。将pVAX-miniSeVGluc(-)和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒共转染BSR T7/5细胞(稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞)检测到Gluc的高效表达,表明pVAX-miniSeV-Gluc(-)能够被有效拯救;但在BHK-21细胞中却未检测到Gluc的有效表达,提示该载体中的CMV启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率可能没有明显作用。为了进一步了解CMV与T7启动子各自对于仙台病毒微小基因组拯救的作用,本研究又构建了单独含有CMV或T7启动子的仙台病毒微小基因组载体pCMV-miniSeV-Gluc(-)和pT7-miniSeV-Gluc(-)。将这两种载体和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒分别共转染BSR T7/5细胞,结果pT7-miniSeV-Gluc(-)共转染组检测到了Gluc的高效表达,而pCMV-miniSeV-Gluc(-)共转染组未检测到,证实了通用型载体pVAX-miniSeV中仅T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救起了关键作用,而CMV启动子作用不明显。本研究成功构建了一种通用型双启动子仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV,并证明了T7启动子系统对仙台病毒微小基因组拯救的关键作用。本研究为下一步构建仙台病毒全基因感染性克隆打下了基础。

关键词： T7启动子 CMV启动子仙台病毒微小基因组

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miR-122启动子序列的克隆及特异性分析

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国际遗传学杂志 2011年第6期34卷 287-293页

作者：张超武帅钦林乐勋陈晓凤杨爱英沃晓嫚钟照华赵文然哈尔滨医科大学细胞生物学教研室哈尔滨医科大学微生物学教研室

目的 miRNA-122启动子序列的预测、克隆及特异性分析。方法分别从肝癌细胞系Huh-7及HepG2中扩增出预测的miR-122启动子,并将其克隆至含荧光素酶(fireflyluciferase,Fluc)报告基因pGL4.17质粒上,用重组质粒转染IHuh-7、HepG2及HeLa细胞,... 详细信息

目的 miRNA-122启动子序列的预测、克隆及特异性分析。方法分别从肝癌细胞系Huh-7及HepG2中扩增出预测的miR-122启动子,并将其克隆至含荧光素酶(fireflyluciferase,Fluc)报告基因pGL4.17质粒上,用重组质粒转染IHuh-7、HepG2及HeLa细胞,分析启动子的特性。结果成功预测并克隆出miR-122的启动子序列。重组质粒转染细胞后,启动子能够启动Fluc的表达。用含启动子P1的重组载体pGL4.17-P1转染HeLa细胞后,用两种荧光素酶检测体系测得重组载体中荧光素酶的表达水平显著高于对照组(t=0.000 21,P<0.01及t=0.000 38,P<0.01)。结论 Huh-7、HepG2细胞中miR-122表达差异与启动子序列缺失无关。而受miR-122启动子调节的报告基因在非肝细胞系(HeLa)中也表达,表明miR-122启动子不具有肝细胞特异性。

关键词： miR-122 启动子肝特异性报告基因

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B组3型柯萨奇病毒自噬蛋白和基序的鉴定

B组3型柯萨奇病毒自噬蛋白和基序的鉴定

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第九届全国病毒学学术研讨会

作者：王瑞雪秦颖王天楹王燕赵文然佟雷张凤民钟照华哈尔滨医科大学微生物学教研室哈尔滨150081 哈尔滨医科大学细胞生物学教研室哈尔滨150081

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DNA-PK对肠道病毒71型感染神经细胞的影响

DNA-PK对肠道病毒71型感染神经细胞的影响

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第九届全国病毒学学术研讨会

作者：陈晓凤秦颖郭志伟王天楹王燕赵文然张凤民钟照华哈尔滨医科大学微生物学教研室哈尔滨150081 哈尔滨医科大学细胞生物学教研室哈尔滨150081

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H9c2细胞对B组柯萨奇病毒3型重组株的易感性

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微生物与感染 2011年第2期6卷 78-83页

作者：林乐勋赵文然武帅钦佟雷王燕张凤民钟照华哈尔滨医科大学病原生物学实验教学中心哈尔滨150081 哈尔滨医科大学微生物学教研室黑龙江省感染与免疫重点实验室哈尔滨150081 哈尔滨医科大学细胞生物学教研室哈尔滨150081

H9c2细胞是来源于大鼠胚胎心脏组织的成肌细胞系,B组柯萨奇病毒(group B Coxsackievirus,CVB)是心肌炎和扩张型心肌病的主要病原。本研究观察了CVB3在H9c2细胞中的感染性,探讨H9c2细胞是否可用于CVB致心肌疾病的实验研究。用整合了增强... 详细信息

H9c2细胞是来源于大鼠胚胎心脏组织的成肌细胞系,B组柯萨奇病毒(group B Coxsackievirus,CVB)是心肌炎和扩张型心肌病的主要病原。本研究观察了CVB3在H9c2细胞中的感染性,探讨H9c2细胞是否可用于CVB致心肌疾病的实验研究。用整合了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或海肾荧光素酶(RLuc)的CVB3重组株EGFP-CVB3、RLuc-CVB3攻击H9c2细胞及大、小鼠原代心肌细胞和骨骼肌细胞,应用荧光显微镜、流式细胞术和化学发光技术观察感染细胞的EGFP和RLuc表达,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测病毒在核酸水平的表达。结果显示,在病毒攻击的H9c2细胞未检测到EGFP和RLuc表达;RT-PCR显示在CVB3感染9 d后检测不到CVB3 RNA;CVB3毒株可感染小鼠心肌细胞、骨骼肌细胞和大鼠心肌细胞,但不感染大鼠骨骼肌细胞和H9c2细胞。本研究结果表明,H9c2细胞不是CVB3易感细胞,不能用于CVB3致心肌疾病的研究;该结果从病毒感染方面也支持H9c2具有大鼠骨骼肌细胞表型。

关键词： H9c2细胞 B组柯萨奇病毒3型心肌细胞骨骼肌细胞鼠

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病原体感染与铁代谢

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热带病与寄生虫学 2011年第4期9卷 240-242页

作者：韩甦张晓丽陈小贝张凤民哈尔滨医科大学基础医学院人体寄生虫学和微生物学教研室、黑龙江省病原生物学感染与免疫重点实验室哈尔滨医科大学公共卫生学院卫生检验中心

铁(Iron)是人体必需的微量元素,广泛参与机体生命代谢活动,如通过催化氧化-还原反应参与细胞线粒体内电子传递和能量的代谢:参与构成血红蛋白、肌红蛋白在组织间协助氧和二氧化碳的运输:参与免疫反应、遗传物质DNA的合成等。铁缺乏会导... 详细信息

铁(Iron)是人体必需的微量元素,广泛参与机体生命代谢活动,如通过催化氧化-还原反应参与细胞线粒体内电子传递和能量的代谢:参与构成血红蛋白、肌红蛋白在组织间协助氧和二氧化碳的运输:参与免疫反应、遗传物质DNA的合成等。铁缺乏会导致机体贫血和免疫系统的损害;而铁沉积通过Fenton反应可增强自由基介导的氧化应激对组织和细胞造成损伤。由此可见,铁代谢与机体的生命活动密切相关。铁代谢的变化与病原体感染导致的疾病之间的关系正受到更多的关注。

关键词：铁代谢铁蛋白金属蛋白铁沉积病原体病原物

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5＇非编码区嘧啶富集区变异对B组柯萨奇病毒1型毒力的影响

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中国地方病学杂志 2010年第4期29卷 362-366页

作者：钟照华包琳李倩张燕芳范徐妃李晓波张凤民赵文然哈尔滨医科大学微生物学教研室黑龙江省感染与免疫重点实验室 150081 哈尔滨医科大学细胞生物学教研室 150081 内蒙古民族大学临床医学院微生物和免疫学教研室

目的观察5＇非编码区（5＇UTR）嘧啶富集区变异对B组柯萨奇病毒1型（CVB1）毒力和致病性的影响.方法定点诱变将CVB1基因组5＇UTR第563～573碱基嘧啶富集区5个嘧啶置换为嘌呤,获得突变株CVB1/m563-573.空斑纯化病毒后,利用细胞病变效应... 详细信息

目的观察5＇非编码区（5＇UTR）嘧啶富集区变异对B组柯萨奇病毒1型（CVB1）毒力和致病性的影响.方法定点诱变将CVB1基因组5＇UTR第563～573碱基嘧啶富集区5个嘧啶置换为嘌呤,获得突变株CVB1/m563-573.空斑纯化病毒后,利用细胞病变效应（CPE）试验、空斑形成试验、一步生长曲线和半数致死量（LD50）等方法比较CVB1/m563-573与其原型株CVB1/wt的毒力.结果测序结果显示,CVB1/m563-573的5＇UTR嘧啶富集区发生C565A、U567C、U568A、U570A、U572G突变,与预期一致.CPE试验表明,CVB1/m563-573的感染性较CVB1/wt稍弱（A 490分别为0.710±0.074、0.812±0.092）,但差异无统计学意义（t=-2.204,P〉0.05）.空斑形成试验显示,46、58 h时间点CVB1/m563-573形成空斑的数量为（6.40±1.52）×103、（11.60±2.19）×103 pfu（空斑形成单位）/L,直径为（2.00±0.35）、（2.47±0.41）mm,CVB1/wt的空斑数量为（8.40±2.51）×103、（11.80±1.92）×103 pfu/L,直径为（1.80±0.27）、（2.85±0.44）mm,二者比较差异无统计学意义（t值分别为8.000、0.985、10.000、9.000,P均〉0.05）.一步生长曲线法显示,经过3、5、7 h的扩增,CVB1/m563-573所得的活病毒颗粒数（×103 pfu/L）的常用对数（lg）分别为2.10±0.09、4.28±0.03、7.44±0 CVB1/wt的活病毒颗粒数（×103 pfu/L）的lg值分别为2.80±0.02、4.77±0.02、8.55±***1/m563-573株在3个时间点均较CVB1/wt复制显著慢（t值分别为-13.151、-24.319、-47.714,P均〈0.01）.CVB1/m563-573和CVB1/wt的LD50分别为3.10×109、1.26×107 pfu/L,CVB1/m563-573致病力较CVB1/wt明显减弱.结论减少5＇UTR嘧啶富集区的嘧啶碱基数量可致CVB1的感染和毒力减弱,该位点突变可能是研发CVB减毒活疫苗的策略之一.

关键词：肠道病毒属嘧啶富集区诱变定点毒力

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水痘-带状疱疹病毒临床分离株基因特征分析

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中华流行病学杂志 2010年第2期31卷 189-193页

作者：甘霖王明丽赵俊陈敬贤安徽医科大学微生物学教研室合肥230032 美国哥伦比亚大学病理和细胞生物学系

目的运用分子生物学方法对水痘或带状疱疹患者皮肤水疱液及水痘疫苗中分离得到的水痘-带状疱疹病毒（VZV）株进行基因特征分析。方法从水痘疫苗、水痘或带状疱疹患者的皮肤水疱液中分离VZV，然后利用聚合酶链反应和限制性片段长度多态... 详细信息

目的运用分子生物学方法对水痘或带状疱疹患者皮肤水疱液及水痘疫苗中分离得到的水痘-带状疱疹病毒（VZV）株进行基因特征分析。方法从水痘疫苗、水痘或带状疱疹患者的皮肤水疱液中分离VZV，然后利用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性对病毒株的ORFs6、38、62进行分析，同时测序分析ORFs1、31、51和62中的单个核苷酸多态性位点。结果4种疫苗酶切结果均为AluI^-PstI SmaI^＋BssHⅡ^＋NaeI^＋，49株vzv临床分离株中AluI^＋PstI^-SmaI^-BssHⅡ^-NaeI^-占96％（47株），AluI^-PstI^-SmaI^＋BssHⅡ^＋占2％（1株），AluI^＋PstI^-SmaI^-BssHⅡNaeI^-占2％（1株），其中1例患者的临床分离病毒株与疫苗一致；测序分析显示不同疫苗核苷酸序列之间存在差异，分离得到的疫苗株病毒序列与Varikrux一致。结论存在疫苗引起水痘的情况，测定ORFs6、62中的限制性片段长度多态性能够区分疫苗株和野毒株，对ORFs1、31、51和62中的单个核苷酸多态性位点进行分析可追踪疫苗致病的病毒株来源。

关键词：水痘-带状疱疹病毒水痘疫苗临床分离株

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