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四川大学学报（医学版） 2006年第6期37卷 839-843页

作者：孙剑王健琪翟朝阳四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学实验室成都610041

目的构建人内皮抑素(humanendostatin,hES)原核表达质粒pET28a/hES并与简化人纤溶酶原饼环区5(predigestedhumanplasminogenkringle5,predhPK-5)在大肠杆菌中实现共表达。方法RT-PCR法从人肝癌组织中扩增人内皮抑素基因,利用基因克隆技术构建原核表达质粒pET28a/hES。在卡那霉素与氨苄青霉素的选择压力下,将其与pGEX-1λT/predhPK-5共同转化***21(DE3),并诱导表达重组蛋白。同时从连续培养时间与传代次数两方面检测了共转化子的稳定性。结果成功构建了重组质粒pET28a/hES,其与pGEX-1λT/predh-PK-5的共转化子在双抗生素压力下可以共存,并在***21(DE3)中成功共表达了人内皮抑素及简化的人纤溶酶原饼环区5,其表达量分别占蛋白总量的20%和21%。在双抗性培养基中培养16h及传代120代,共转化子存活率均大于75%,具有较好的稳定性。结论不相容质粒pET28a/hES与pGEX-1λT/predhPK-5在大肠杆菌中的成功共表达,对基因共表达方法作了有益探索,验证了不相容质粒共表达方法的可行性。

关键词：抗血管生成人内皮抑素简化人纤溶酶原饼环区5 不相容质粒共表达

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MKK6过表达调控SIRT1影响食管癌细胞肿瘤行为学的体外研究

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四川大学学报（医学版） 2015年第4期46卷 548-553页

作者：杨晓龙胡开锋刘明佳任朋亮陈利弘刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的向食管癌Eca109细胞中转染pcDNA3.1(+)/myc-His A-丝裂原活化蛋白激酶6(MKK6)重组过表达载体,观察过表达MKK6影响沉默信息转录调控因子(SIRT1)表达后肿瘤细胞增殖、凋亡以及侵袭力发生的变化,探讨p38-MAPK-SIRT1调节轴的存在性及其... 详细信息

目的向食管癌Eca109细胞中转染pcDNA3.1(+)/myc-His A-丝裂原活化蛋白激酶6(MKK6)重组过表达载体,观察过表达MKK6影响沉默信息转录调控因子(SIRT1)表达后肿瘤细胞增殖、凋亡以及侵袭力发生的变化,探讨p38-MAPK-SIRT1调节轴的存在性及其对Eca109细胞各项肿瘤行为学造成的影响。方法根据GenBank中MKK6基因的mRNA序列设计引物,构建MKK6过表达载体;将Eca109细胞分空载体转染组、MKK6过表达载体转染组、MKK6-SIRT1ShRNA共转染组和MKK6-RES(白藜芦醇)组,相应处理后,采用Western blot测定各组Eca109细胞的SIRT1及MKK6表达水平,MTT法检测各组Eca109细胞的增殖活力,Transwell法观察各组Eca109细胞的侵袭力,流式细胞术检测各组Eca109细胞的凋亡情况。结果测序结果表明成功构建MKK6过表达载体;转染MKK6过表达载体可降低Eca109细胞的内源性SIRT1表达,减弱Eca109细胞的增殖活力,促其凋亡,同时可使Eca109细胞的侵袭力增强,以上各项改变均与SIRT1的表达水平有关。结论Eca109细胞内可能存在p38-MAPK-SIRT1调节轴,MKK6及其下游因子对SIRT1可能具有反馈调节作用,可引起Eca109细胞各项肿瘤行为学的变化。

关键词： MKK6 SIRT1 Eca109细胞细胞活力细胞侵袭力细胞凋亡反馈调节轴

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microRNA启动子区甲基化调控对人肺癌细胞A549增殖、迁移、侵袭的影响

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四川大学学报（医学版） 2019年第2期50卷 182-187页

作者：彭恒董婧颖赵亚楠吴文兵杨晓龙陈丹胡开锋陈利弘刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的研究microRNA启动子区甲基化水平的变化对几种microRNAs(miRNA34a、miRNA34b、miRNA148a、miRNA203a)表达的影响,并进一步研究该甲基化调控对人肺癌细胞A549增殖、迁移以及侵袭能力的影响。方法不同浓度的去甲基化药物5-氮杂-2′-... 详细信息

目的研究microRNA启动子区甲基化水平的变化对几种microRNAs(miRNA34a、miRNA34b、miRNA148a、miRNA203a)表达的影响,并进一步研究该甲基化调控对人肺癌细胞A549增殖、迁移以及侵袭能力的影响。方法不同浓度的去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理人肺癌细胞A549,分别作用24 h、48 h、72 h,采用CCK8法检测细胞增殖情况,计算增殖抑制率。20μmol/L 5-Aza-CdR处理A549细胞72 h,通过甲基化特异性PCR(MSP)检测A549细胞相关miRNAs启动子甲基化水平的变化;实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测A549细胞相关miRNAs表达水平的变化。20μmol/L 5-Aza-CdR处理A549细胞0 h、24 h、48 h,采用划痕实验检测细胞迁移能力(计算细胞在24 h和48 h的划痕愈合率);作用48 h,采用Transwell检测细胞侵袭能力。结果 CCK8结果显示,随着5-Aza-CdR的处理浓度升高、时间延长,A549细胞的增殖抑制率逐渐增加。经5-Aza-CdR去甲基化处理后,MSP结果表明,实验组相对于对照组甲基化引物扩增条带减弱,而非甲基化引物扩增条带增强;Real-time PCR结果显示,相关miRNAs表达水平升高(P<0.05)。由划痕实验和Transwell检测结果揭示,经5-Aza-CdR处理后,A549细胞的生长愈合能力降低(P<0.05),并且侵袭到Transwell小室滤膜下表面的细胞数亦减少(P<0.05)。结论人肺癌细胞A549经5-Aza-CdR去甲基化处理后,miRNAs表达水平升高,进一步抑制肺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。

关键词：肺癌A549细胞株 microRNA 甲基化增殖迁移侵袭

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过表达miR-18a靶向ATM对结肠癌细胞增殖和迁移的影响

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四川大学学报（医学版） 2016年第4期47卷 451-457页

作者：刘明佳陈利弘胡开锋杨晓龙董婧颖刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的研究miR-18a通过靶基因共济失调-毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia mutated gene,ATM)调控结肠癌细胞的生物学特性。方法通过软件预测miR-18a其中一个靶基因。设计合成miR-18a的模拟剂(mimics)和抑制剂(inhibitor),通过... 详细信息

目的研究miR-18a通过靶基因共济失调-毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia mutated gene,ATM)调控结肠癌细胞的生物学特性。方法通过软件预测miR-18a其中一个靶基因。设计合成miR-18a的模拟剂(mimics)和抑制剂(inhibitor),通过转染不同组分上调或下调内源性miR-18a在结肠癌细胞株HCT116中的表达。采用实时荧光定量(qRT)-PCR、Western blot、MTT法、克隆形成实验、Transwell等方法,检测过表达miR-18a调控ATM基因的表达对体外结肠癌细胞增殖及迁移能力的影响。结果软件预测发现miR-18a的其中一个靶基因是ATM。通过瞬时转染,过表达内源性miR-18a,可降低HCT116细胞内靶基因ATM蛋白的表达水平。转染miR-18amimics后能够下调HCT116细胞的增殖活力,同时显著降低HCT116细胞的克隆形成能力、横向迁移能力及纵向侵袭能力,以上各项改变均与miR-18a过表达有关。结论证实了miR-18a通过负向调控ATM的表达,抑制结肠癌细胞HCT116的增殖和迁移能力。

关键词： miR-18a ATM 增殖迁移结肠癌细胞 HCT116

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高甘油三酯血症大鼠高血凝相关基因的筛选

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四川大学学报（医学版） 2003年第3期34卷 401-404页

作者：赵玉华刘秉文白怀四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室

目的　筛选实验性高甘油三酯血症诱发大鼠高血凝的相关基因。方法　采用抑制性消减杂交技术构建大鼠高血凝 c DNA消减文库 ,并用半定量 RT- PCR初步鉴定差异表达基因。结果　成功构建了大鼠高血凝 c D-NA消减文库 ,2 0个阳性克隆的序列... 详细信息

目的　筛选实验性高甘油三酯血症诱发大鼠高血凝的相关基因。方法　采用抑制性消减杂交技术构建大鼠高血凝 c DNA消减文库 ,并用半定量 RT- PCR初步鉴定差异表达基因。结果　成功构建了大鼠高血凝 c D-NA消减文库 ,2 0个阳性克隆的序列测定和同源比较表明这些克隆代表了 19个基因 ,其中 8个为已知基因但首次发现与高血凝相关 ,11个为新的 ESTs,已被 Gen Bank收录。半定量 RT- PCR证明 3个 ESTs( HC0 0 2、HC0 5 7和HC0 67)为表达上调基因。结论　所构建的消减文库消减效率高 ,为进一步筛选、克隆大鼠高血凝相关的新基因奠定了基础 ,HC0 0 2、HC0 5 7和 HC0

关键词：高甘油三酯血症大鼠高血凝基因筛选

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过氧化氢诱导的人正常和早老细胞中DNA损伤及其修复研究

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四川大学学报（医学版） 2011年第5期42卷 610-615页

作者：所起凤杜文婷杨鸣鸣范雪娇刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的研究人早老细胞和正常衰老细胞在氧化应激条件下的DNA损伤和修复。方法采用免疫荧光技术和彗星电泳技术,分别检测3组不同群体倍增数(PD)的人正常二倍体成纤维细胞BJ(青年组第14代,成年组第30代,衰老组第45代)和2组不同PD的人赫-吉... 详细信息

目的研究人早老细胞和正常衰老细胞在氧化应激条件下的DNA损伤和修复。方法采用免疫荧光技术和彗星电泳技术,分别检测3组不同群体倍增数(PD)的人正常二倍体成纤维细胞BJ(青年组第14代,成年组第30代,衰老组第45代)和2组不同PD的人赫-吉二氏综合征(HGPS)细胞(青年组第8代,衰老组第17代)的DNA基础损伤程度。研究过氧化氢诱导造成以上细胞组DNA损伤及去除致损因素正常培养后的修复水平,采用免疫荧光和彗星电泳技术检测细胞在沉默DNA损伤修复蛋白着色性干皮病蛋白A(XPA)表达前后的修复能力。结果 BJ细胞衰老组DNA损伤程度较高,与成年组相比,对DNA损伤诱导因子更加敏感(P<0.05);成年组与青年组相比,对损伤诱导因子也更敏感(P<0.05)。HGPS细胞青年组的DNA基础损伤程度即已达到衰老BJ细胞类似或更高水平,且与BJ细胞具有一致的DNA损伤年龄变化趋势。经siRNA沉默XPA表达后可部分恢复HGPS细胞的修复能力,对BJ细胞则没有影响。随年龄增长无论正常还是早老细胞,DNA损伤程度增加,修复效率降低。结论 XPA功能异常抑制了HGPS细胞的损伤修复。

关键词：彗星电泳免疫荧光过氧化氢 DNA损伤 DNA修复

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人肝脏高凝状态相关基因的筛选

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四川大学学报（医学版） 2005年第5期36卷 605-608页

作者：崔晓燕汤慧方定志刘秉文四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的筛选人肝脏高凝状态(PTS)相关基因的全长cDNA序列。方法采用差异筛选法对本室建立的PTS大鼠肝脏差异表达基因消减cDNA文库进行筛选;以获得的差异cDNA克隆为模板,采用PCR方法扩增目的片段;以PCR产物作探针,用噬菌斑原位杂交法筛选人... 详细信息

目的筛选人肝脏高凝状态(PTS)相关基因的全长cDNA序列。方法采用差异筛选法对本室建立的PTS大鼠肝脏差异表达基因消减cDNA文库进行筛选;以获得的差异cDNA克隆为模板,采用PCR方法扩增目的片段;以PCR产物作探针,用噬菌斑原位杂交法筛选人肝脏cDNA文库,经初筛、二筛和三筛后,将获得的阳性克隆转入***25.8,使λTripIEx环化成质粒pTripIEx,经酶切鉴定后进行DNA测序。结果从人肝脏cDNA文库中筛选获得4条全长cDNA序列,经序列测定及生物信息学分析发现,其中3条的表达产物分别为纤维蛋白原、纤维蛋白原相关蛋白、10号染色体开放阅读框架104mRNA;另1条与氨基甲酰磷酸合成酶1同源。结论以PTS大鼠肝脏差异表达基因cDNA为探针,从人肝脏cDNA文库中筛选获得4条PTS相关cDNA全长序列。

关键词：差异表达基因 cDNA文库高凝状态肝脏

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MicroRNA-34a调控细胞衰老的研究

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四川大学学报（医学版） 2013年第1期44卷 1-5页

作者：杨鸣鸣范雪娇杜文婷任鹏亮刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的探讨微RNA-34a(miRNA-34a)对细胞通过调控沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)的表达,从而引起细胞衰老的作用。方法构建pre-miRNA-34a表达载体,并将其和一个不针对任何基因的微小RNA-1792(miRNA-1792)表达载体(其他实验室赠送... 详细信息

目的探讨微RNA-34a(miRNA-34a)对细胞通过调控沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)的表达,从而引起细胞衰老的作用。方法构建pre-miRNA-34a表达载体,并将其和一个不针对任何基因的微小RNA-1792(miRNA-1792)表达载体(其他实验室赠送)分别转染至HEK293和HUVEC细胞内,用RT-PCR、Western blot检测各细胞组SIRT1mRNA与蛋白表达水平,以未转染的细胞为对照;将HUVEC细胞分为转染不同质粒、未转染质粒和用SIRT1激活剂白藜芦醇(终浓度1μmol/L,作用2h)处理HUVEC细胞(HUVEC-Res)组,中性彗星电泳分析H2O2作用2h后4组HUVEC细胞的双链损伤情况;用阿霉素处理上述4组HUVEC细胞2h,β-半乳糖甘酶(SA-β-gal)染色检测各细胞不同时间点的衰老情况。结果测序结果表明pre-miRNA-34a表达载体构建成功;RT-PCR、Western blot显示HEK293-pre-miRNA-34a和HUVEC-pre-miRNA-34a中SIRT1mRNA和蛋白质表达的水平明显下降(P<0.001);中性彗星电泳检测发现经H2O2处理后,HUVEC-Res组DNA损伤最轻,而HUVEC-miRNA-34a组DNA损伤程度最为严重;SA-β-gal染色显示DNA损伤后HUVEC-miRNA-34a衰老程度较其它3组严重,而HUVEC-Res组的衰老程度最为轻微。结论 miRNA-34a通过抑制SIRT1表达调控细胞衰老。

关键词： miRNA-34a SIRT1细胞衰老DNA损伤

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DNA损伤修复基因XRCC4、RAD51单核苷酸多态性与中国地区食管癌易感相关性研究

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四川大学学报（医学版） 2013年第4期44卷 568-572页

作者：范雪娇任朋亮卢钟娇赵书杨晓龙刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的探究DNA双链断裂修复基因XRCC4、RAD51单核苷酸多态性与食管癌易感性的关系。方法采用以医院为基础的病例-对照研究方法,应用PCR限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)检测包括正常对照61例,食管癌患者123例XRCC4基因启动子区G-1394... 详细信息

目的探究DNA双链断裂修复基因XRCC4、RAD51单核苷酸多态性与食管癌易感性的关系。方法采用以医院为基础的病例-对照研究方法,应用PCR限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)检测包括正常对照61例,食管癌患者123例XRCC4基因启动子区G-1394T(rs6869366)位点,以及RAD51-G135C位点的单核苷酸多态性。通过logistic回归分析计算出比值比(OR)和95%置信区间(95%CI)。结果 XRCC4rs6869366位点G等位基因的基因型(GT+GG)的携带者患食管癌的风险显著增加(OR=3.022,95%CI=1.487～6.142,P=0.002)。RAD51基因型GC和CC与携带GG的野生型个体相比,携带RAD51变异基因型(GC和CC)的个体具有更高的患癌风险(OR=3.643,95%CI=1.501～8.842,P<0.05)。结论 DNA损伤修复系统中的基因多态性很可能与食管癌发生的易感性有关,XRCC4G-1394T,RAD51-G135C位点多态性改变均可增加食管癌的发病风险。

关键词： XRCC4 RAD51 食管癌单核苷酸多态性

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中药成分CDP逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子低转录活性的研究

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四川大学学报（医学版） 2007年第5期38卷 761-765页

作者：张军哲王锦红覃扬傅强四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的研究中药成分CDP逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子低转录活性的作用。方法构建含完全甲基化GSTP1启动子区的重组质粒pGL3-GSTP1prom并转染MCF-7细胞,分别用不同剂量的CDP和5-aza-C作用细胞,检测表达的萤光素酶活性。观察GSTP1启... 详细信息

目的研究中药成分CDP逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子低转录活性的作用。方法构建含完全甲基化GSTP1启动子区的重组质粒pGL3-GSTP1prom并转染MCF-7细胞,分别用不同剂量的CDP和5-aza-C作用细胞,检测表达的萤光素酶活性。观察GSTP1启动子转录活性的变化。结果GSTP1启动子区被完全甲基化后转录活性显著降低;CDP能够逆转高甲基化状态下GSTP1基因启动子区的低转录活性且呈剂量依赖关系。结论中药成分CDP能够逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子区的低转录活性。

关键词： CDP 高甲基化GSTP1启动子 MCF-7 转染萤光素酶报告基因

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