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2018年中国水产学会学术年会

作者：苏惠冰魏钰娟孙晶杨宗英胡鲲杨先乐上海海洋大学国家水生动物病原库水产科学国家级实验教学示范中心农业部淡水水产种质资源重点实验室江西省南昌市农业科学院

本文探讨0.1%、0.2%、0.3%的乳酸饲料对恩诺沙星在中华绒螯蟹体内残留消除规律的影响。通过单次口灌10mg/kg剂量的恩诺沙星,使用HPLC测定血淋巴、肝胰腺和肌肉样品中恩诺沙星的浓度。结果显示:根据单因素方差分析,乳酸对所有组织的恩诺... 详细信息

本文探讨0.1%、0.2%、0.3%的乳酸饲料对恩诺沙星在中华绒螯蟹体内残留消除规律的影响。通过单次口灌10mg/kg剂量的恩诺沙星,使用HPLC测定血淋巴、肝胰腺和肌肉样品中恩诺沙星的浓度。结果显示:根据单因素方差分析,乳酸对所有组织的恩诺沙星峰浓度(C)具有显著性差异（p<0.05）。血淋巴、肝胰腺和肌肉组织中恩诺沙星的C随乳酸浓度（0.1%-0.3%）的增加而增加,T随乳酸浓度的增加而增加快。在血淋巴、肝胰腺和肌肉组织中的恩诺沙星的t随着乳酸浓度的增加而下降;当乳酸浓度为0.3%时,恩诺沙星的消除速度更快。0.3%乳酸组中各组织的AUC最低。这些结果表明,0.3%浓度的乳酸有助于中华绒螯蟹体内恩诺沙星的消除。这可能因为乳酸诱导肝胰腺的生物转化增强,导致恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的残留消除规律出现差异。

关键词：恩诺沙星药代动力学中华绒螯蟹乳酸有机酸

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草鱼呼肠孤病毒通过NS31诱导热休克蛋白HSP70和HSP30表达

草鱼呼肠孤病毒通过NS31诱导热休克蛋白HSP70和HSP30表达

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2017年中国水产学会学术年会

作者：喻飞李婉娟王浩王龙龙吕利群国家水生动物病原库农业部淡水种质资源重点实验室上海海洋大学水产与生命学院

为了研究草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)非结构蛋白NS31在病毒复制过程中的功能以及GCRV的非结构蛋白对病毒致病性的影响,本实验利用转录组测序方法对过表达NS31蛋白的草鱼肾脏细胞相对于对照组的差异基因进行分析和CIK细胞... 详细信息

为了研究草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)非结构蛋白NS31在病毒复制过程中的功能以及GCRV的非结构蛋白对病毒致病性的影响,本实验利用转录组测序方法对过表达NS31蛋白的草鱼肾脏细胞相对于对照组的差异基因进行分析和CIK细胞感染GCRV 12 h和20 h相对于对照组的差异基因分析,以及利用定量RT-PCR方法进一步验证转录组测序的结果。转录组数据分析结果显示NS31过表达诱导了热休克蛋白HSP70和HSP30在CIK细胞中高表达,同样GCRV病毒在12h和20h分别诱导HSP70和HSP30上调;利用定量RT-PCR方法进一步验证结果显示NS31过表达诱导了热休克蛋白HSP70和HSP30在CIK细胞中高表达,分别上调52.17和35.75倍,GCRV病毒感染CIK细胞12 h后诱导HSP70和HSP30,最高分别上调,同时在CIK细胞中NS31过表达,GCRV感染不影响热休克蛋白HSC70和HSP90的转录水平。该研究为阐述GCRV诱导热休克效应机制奠定了基础。

关键词： GCRV 热休克蛋白 NS31 HSP70,HSP30

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草鱼呼肠孤病毒GCRV VP56相互作用蛋白的鉴定

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水产学报 2016年第3期40卷 371-378页

作者：喻飞王浩宗乾坤张娅楠刘海云陈百朋吕利群上海海洋大学水产与生命学院国家水生动物病原库上海海洋大学水产与生命学院农业部淡水种质资源重点实验室

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白VP56与宿主蛋白的相互作用,实验采用酵母双杂交Gal4系统鉴定与VP56相互作用的草鱼蛋白。首先利用RT-PCR技术从Ⅱ型GCRV感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因VP56,构建p GBKT7-VP56诱饵表达载体;在酵母菌... 详细信息

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白VP56与宿主蛋白的相互作用,实验采用酵母双杂交Gal4系统鉴定与VP56相互作用的草鱼蛋白。首先利用RT-PCR技术从Ⅱ型GCRV感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因VP56,构建p GBKT7-VP56诱饵表达载体;在酵母菌株中检测其自激活性后,以VP56为诱饵在草鱼酵母双杂交文库中筛选阳性菌株,并对阳性克隆的序列进行分析。实验也克隆了草鱼JAM-A(Gc JAM-A)基因,并构建p GADT7-Gc JAM-A载体,在酵母中研究草鱼Gc JAM-A与病毒蛋白VP56相互作用的可能性。研究表明构建的诱饵质粒p GBKT7-VP56无自激活作用,可以应用于酵母双杂交筛选;从草鱼肾细胞文库中筛选得到9株阳性克隆,基因测序及序列分析确定其中包含草鱼7个细胞内蛋白和1个细胞外基质蛋白;VP56蛋白与Gc JAM-A蛋白在酵母中不能发生相互作用。本研究初步确定了与Ⅱ型GCRV蛋白VP56存在潜在相互作用的宿主蛋白,为深入探讨VP56蛋白在Ⅱ型GCRV感染宿主过程中的生物学功能奠定了基础。

关键词：草鱼呼肠孤病毒 VP56蛋白酵母双杂交 Gc JAM-A蛋白

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草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP5与VP7相互作用结构域的鉴定及分析

草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP5与VP7相互作用结构域的鉴定及分析

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中国水产学会鱼病专业委员会2017年学术讨论会

作者：刘玮莎王浩吕利群国家水生动物病原库(上海海洋大学) 国家水生动物病原库(上海海洋大学) 农业部淡水种质资源重点实验室(上海海洋大学) 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)能够感染草鱼、青鱼等,引起草鱼出血病.GCRV病毒为呼肠孤病毒科(Reoviridae)、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus),无囊膜,具有双链RNA结构,编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白,其中由M5基因、S10基... 详细信息

草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)能够感染草鱼、青鱼等,引起草鱼出血病.GCRV病毒为呼肠孤病毒科(Reoviridae)、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus),无囊膜,具有双链RNA结构,编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白,其中由M5基因、S10基因编码的蛋白VP5、VP7是病毒粒子外衣壳蛋白,方勤等通过冷冻电子显微技术对GCRV病毒粒子的精细结构进行了分子水平的三维重构,发现其VP7位于病毒颗粒最外围与VP5形成异源二聚体,并且根据其课题组研究报道,利用酶解法消化掉GCRV病毒外衣壳蛋白质VP7,能够显著性地增强GCRV病毒的感染效力,该实验表明GCRV病毒外衣壳蛋白中VP7蛋白更倾向于保护病毒粒子,而VP5蛋白更倾向于作为病毒吸附蛋白,在宿主细胞膜表面识别宿主受体.病毒粒子蛋白衣壳的组装问题一直是病毒学的核心问题之一,我们根据上述所提供的实验数据,进一步研究VP5与VP7蛋白相互作用的分子基础,既是阐明GCRV完整病毒粒子装配的重要一环,也是了解GCRV复制感染起始机制的关键.

关键词：草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白 VP5 VP7 酵母双杂交相互作用

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嗜水气单胞菌性鲫败血症的盐酸沙拉沙星用药方案研究

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2016年第6期44卷 46-52页

作者：宗乾坤徐丽娟吕利群上海海洋大学水产与生命学院国家水生动物病原库农业部淡水种质资源重点实验室上海201306

【目的】研究盐酸沙拉沙星在鲫鱼体内的药代学、药效动力学联合参数，确定盐酸沙拉沙星治疗鲫鱼细菌性疾病的防耐药突变用药方案。[方法】测定盐酸沙拉沙星对嗜水气单胞菌的体外最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）、抗菌后效应（... 详细信息

【目的】研究盐酸沙拉沙星在鲫鱼体内的药代学、药效动力学联合参数，确定盐酸沙拉沙星治疗鲫鱼细菌性疾病的防耐药突变用药方案。[方法】测定盐酸沙拉沙星对嗜水气单胞菌的体外最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）、抗菌后效应（PAE）、防耐药突变浓度（MPC）和防耐药突变选择窗（MSW）；给鲫经口灌服不同剂量（20，30，40mg／kg）的盐酸沙拉沙星，于给药后0．5，1，2，4，6，8，10，12，16，24，48h取血清及肌肉样品，研究盐酸沙拉沙星在鲫鱼体内的药代动力学，然后结合药代动力学和药效动力学结果，确定盐酸沙拉沙星防治嗜水气单胞菌引起的鲫鱼细菌性败血症的合理给药方案。【结果】盐酸沙拉沙星对嗜水气单胞菌的MIC为0．5μg／mL，MBC为2．Oμg／mL，MPC为2．5μg／mL，MSW为0．5-2．5μg／mL。按20，30，40mg／kg剂量给鲫鱼经口灌服盐酸沙拉沙星后，鲫鱼体内的血药质量浓度大于MPC的维持时间分别为0，4．0，24．0h；AUC24／MIC分别为8．44，78．20，164．96；Cmax／MIC分别为4．496，6．662，15．294。【结论】40mg／kg灌服剂量能使鲫的血药浓度维持在MPC以上的时间≥（24一PAE）h、AUC24／MIC≥100或Cmax／MIC〉8，因此建议盐酸沙拉沙星防治嗜水气单胞菌引起的鲫鱼细菌性败血症的防突变用药方案为：给药剂量40mg／kg，每日给药1次，休药期不低于10d。

关键词：鲫盐酸沙拉沙星防耐药突变浓度嗜水气单胞菌药代动力学药效动力学

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盐酸多西环素临床治疗异育银鲫嗜水气单胞菌感染的给药方案的制定

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淡水渔业 2016年第2期46卷 45-49,59页

作者：邴晓菲孙朋辉王浩吕利群国家水生动物病原库农业部淡水种质资源重点实验室上海海洋大学水产与生命学院上海201306

通过高效液相色谱法（HPLC法）测定盐酸多西环素在异育银鲫（Carassius auratus gibelio）血清中不同时间点的血药浓度,并结合药物的体外药效学参数,确定该药的临床给药方案。结果显示,盐酸多西环素对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophil... 详细信息

通过高效液相色谱法（HPLC法）测定盐酸多西环素在异育银鲫（Carassius auratus gibelio）血清中不同时间点的血药浓度,并结合药物的体外药效学参数,确定该药的临床给药方案。结果显示,盐酸多西环素对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,AH10）的最小抑菌浓度（MIC）为0.4μg/m L,最小杀菌浓度（MBC）为3.2μg/m L,防耐药突变浓度（MPC）为4.8μg/m L,耐药选择窗（MSW）为0.4-4.8μg/m L。盐酸多西环素的抗菌后效应（PAE）约为2 h;在异育银鲫中能够达到良好的抑菌杀菌效果的盐酸多西环素口灌剂量是20 mg/kg,休药期至少为25 d;能够控制耐药菌株产生的盐酸多西环素口灌剂量是80 mg/kg,休药期至少为60 d。

关键词：盐酸多西环素异育银鲫(Carassius auratus gibelio) 嗜水气单胞菌(A.hydrophila) 药效动力学药代动力学

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连翘处理对嗜水气单胞菌耐恩诺沙星菌株的转录组影响分析

连翘处理对嗜水气单胞菌耐恩诺沙星菌株的转录组影响分析

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2017年中国水产学会学术年会

作者：姜莺颖董亚萍杨宗英吕新美杨先乐胡鲲上海海洋大学国家水生动物病原库水产科学国家级实验教学示范中心(上海海洋大学) 农业部淡水水产种质资源重点实验室江西省南昌市农业科学院

连翘是一种具有抗菌消炎作用的中药,本研究获取了嗜水气单胞菌耐恩诺沙星菌株（ATCC7966-RS）,对菌株用连翘进行了处理获得相应菌株（ATCC7966-RL）。采用新一代高通量测序技术Illumina HiS eq 2000对耐药菌株和用连翘处理过的菌株进行... 详细信息

连翘是一种具有抗菌消炎作用的中药,本研究获取了嗜水气单胞菌耐恩诺沙星菌株（ATCC7966-RS）,对菌株用连翘进行了处理获得相应菌株（ATCC7966-RL）。采用新一代高通量测序技术Illumina HiS eq 2000对耐药菌株和用连翘处理过的菌株进行进行转录组测序,结合生物信息学方法开展基因表达谱研究和功能基因预测。通过测序,我们分别获得了耐药菌株和连翘处理后菌株组9,647,670和8,352,378个原始序列读取片段。对原始序列进行过滤和质量检查后得出,过滤后的序列片段分别为8,576,608和7,482,820平均长度长为125 bp。Q30的比例大于88%。我们在NCBI上下载了编号为NC08570.1的基因组作为参考基因,两个菌株都有超过98%的clean reads比对到参考基因组上,共得到4117个基因的表达值。耐药菌连翘处理前后共获得了1043个显著的差异表达基因（差异倍数大于2且FDR<0.05）,其中下调基因214个,上调基因829个。对1043个显著的差异表达基因进行COG功能划分,划分结果显示差异表达基因较多的与氨基酸运输和代谢以及转录和能源生产和转化有关。本研究可以帮助我们认识到连翘处理后耐药菌株相关基因的差异表达以及所对应的变异位点,为后续细菌耐药性以及耐药基因的研究奠定基础。

关键词：嗜水气单胞菌恩诺沙星连翘转录组

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嗜水气单胞菌AH10(CCTCC AB2014155)的全基因组测序及比较分析

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中国水产科学 2016年第5期23卷 995-1005页

作者：张国亮王浩张也许丹吕利群国家水生动物病原库农业部淡水水产种质资源利用重点实验室上海海洋大学水产与生命学院上海201306 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心湖北武汉430070

为了解嗜水气单胞菌全基因组信息的结构和功能,对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)AH10(CCTCC保藏号:AB2014155)进行了全基因组测序。将提取的AH10全基因组DNA进行片段化、构建文库后上机测序;将基因组组装后进行注释和比较分析。结... 详细信息

为了解嗜水气单胞菌全基因组信息的结构和功能,对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)AH10(CCTCC保藏号:AB2014155)进行了全基因组测序。将提取的AH10全基因组DNA进行片段化、构建文库后上机测序;将基因组组装后进行注释和比较分析。结果显示:AH10全基因组序列总长度为4.91 Mb,GC含量为61.1%,共预测到4570个基因,3351个基因具有明确的生物学功能。共找到2592个基因具有直系同源族(cluster of orthologous groups,COG)分类,1281个与代谢通路有关的基因,基因组岛31个。比较基因组学研究发现:AH10比对到SNP位点102481个,与Aeromonas hydrophila YL17基因结构共线性最好,与美国来源的嗜水气单胞菌标准菌株Aeromonas hydrophila ATCC 7966具有较近的亲缘关系,AH10的致病性与溶血素基因hly(hemolysin gene)、气溶素基因aer(aerolysin gene)、黏附素基因ahal(major adhesion gene)、丝氨酸蛋白酶基因ahp(serine protease gene)、细胞兴奋性肠毒素基因alt(cytotonic enterotoxin gene)密切相关。这些基因在嗜水气单胞菌中同源性较高。存在自体诱导物信号分子-2(autoinducer-2)与合成信号分子酶基因(signal molecule synthetase gene,ahy Ⅰ)和转录调节蛋白基因(transcriptional regular gene,Ahy R)群体感应(quorum sensing,QS)系统,不存在Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,TTSS)。通过对AH10全基因组序列进行较为全面的注释和比较统计分析,为嗜水气单胞菌的分子生物学研究提供理论支持。

关键词：嗜水气单胞菌基因组测序基因

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一种基于Ⅱ型鲤疱疹病毒衣壳蛋白72的免疫学检测方法

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中国水产科学 2016年第2期23卷 328-335页

作者：孔善云姜有声许丹谢骏吕利群国家水生动物病原库农业部淡水种质资源重点实验室上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室江苏无锡214081

Ⅱ型鲤疱疹病毒(cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)是引起养殖异育银鲫(Carassius auratus gibelio)造血器官坏死症的致病病原。在临床筛查中基于病毒核酸的PCR和real time PCR技术已经建立,但是稳定性更强的免疫学诊断技术国内外尚无报... 详细信息

Ⅱ型鲤疱疹病毒(cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)是引起养殖异育银鲫(Carassius auratus gibelio)造血器官坏死症的致病病原。在临床筛查中基于病毒核酸的PCR和real time PCR技术已经建立,但是稳定性更强的免疫学诊断技术国内外尚无报道。本研究目的是利用Cy HV-2编码的ORF72基因(Gen Bank登录号:AFJ20502.1)所编码的衣壳蛋白作为捕获抗原,通过识别感染病毒的鱼体中的相应抗体,从而对样本进行临床免疫学检测。首先采用PCR方法从纯化的Cy HV-2基因组中扩增ORF72基因,并把该基因克隆至原核表达载体PGEX-4T-3,并转化到大肠杆菌中诱导表达,诱导表达的产物通过SDS-PAGE进行鉴定,对表达的重组蛋白进行纯化。用已纯化的72重组蛋白对小鼠进行免疫,制得72重组蛋白的抗体。Western blot检测表明所制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也可以识别Cy HV-2病毒粒子上的衣壳蛋白72。在上述基础上建立了基于Western blot技术的Cy HV-2抗体检测技术:用纯化的72重组蛋白作为检测抗原,鲫鱼血清用作一抗,兔抗鲫Ig M多克隆抗体作为二抗,酶标羊抗兔作为三抗鉴定鲫鱼是否存在Cy HV-2特异性抗体。在对急性感染期的临床样本检测中,本方法能在所有样本中检测出ORF72特异性抗体存在,表明72重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于确诊鲫鱼是否感染Cy HV-2。本研究建立的实验室免疫学检测方法为商品化免疫学检测技术的开发奠定了基础,对Cy HV-2的检验检疫具有一定的临床应用价值。

关键词： Ⅱ型鲤疱疹病毒 ORF72 原核表达多克隆抗体临床检测异育银鲫

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感染水霉的草鱼组织病理观察及硫酸铜对其感染过程的影响

感染水霉的草鱼组织病理观察及硫酸铜对其感染过程的影响

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2017年中国水产学会学术年会

作者：董亚萍孙琪刘腾飞王会聪杨先乐胡鲲上海海洋大学国家水生动物病原库农业部淡水水产种质资源重点实验室上海黛龙生物科技工程有限公司藁城区农林畜牧局江苏农林职业技术学院

采用寄生水霉(Saprolegnia parasitica)ATCC200013对草鱼进行人工感染,利用扫描电镜观察水霉菌丝在草鱼表皮的附着,通过石蜡切片和HE染色进一步研究水霉对草鱼体表皮肤组织的损伤,进而探讨水霉入侵鱼体的方式与过程;同时利用扫描电镜观... 详细信息

采用寄生水霉(Saprolegnia parasitica)ATCC200013对草鱼进行人工感染,利用扫描电镜观察水霉菌丝在草鱼表皮的附着,通过石蜡切片和HE染色进一步研究水霉对草鱼体表皮肤组织的损伤,进而探讨水霉入侵鱼体的方式与过程;同时利用扫描电镜观察了硫酸铜对寄生水霉的菌丝与孢子形态的影响。研究结果表明:水霉孢子可以以单个或聚集的形式对鱼体造成不同程度的损伤,进而入侵鱼体表皮,并且可以向内和向外萌发菌丝,汲取营养并释放孢子;硫酸铜处理后,水霉菌丝不规则缢缩和膨大、肿胀或干瘪扭曲,坏死,停止生长,孢子产生畸形,出现凹陷破裂,皱缩、干瘪坏死等现象。依据以上结果,推断水霉感染过程的薄弱环节及最佳用药时间段为孢子附着于鱼体后,向体内萌发菌丝前,为筛选防治水霉病的药物提供了参考依据。

关键词：水霉草鱼人工感染组织病理扫描电镜硫酸铜

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