杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是肌营养不良中最常见的类型,其致病基因是编码dytrophin蛋白的DMD基因,外显子缺失/重复是DMD基因突变的主要类型(～70%)。缺失和重复分别存在热点区,缺失突变主要发生在基因的3'中央区,并且第45外显子缺失发生的频率最高,重复突变多发生在基因的5'端。为探讨DMD基因断裂重排易于发生在该基因特定区域以及断裂点形成的潜在机制,我们应用AffymetrixGenome-wide Human SNP Array 6.0对28例单外显子缺失/重复病例以及7例多外显子缺失(均涉及断裂点频发区域第44内含子)病例进行断裂点定位,Gap-PCR扩增断裂点序列并测序。利用RepeatMasker program和Blat program评估断裂点处(±100bp)各种散在重复元件的含量并查找断裂点插入序列的来源。我们成功的克隆了35例DMD患者的断裂点并获得精确序列;35个病例的70个断裂点没有任何两个发生在相同的基因组位置,其中41(58.6%)个断裂点位置与一个或多个散在重复元件重叠:17个与短散在重复元件(SINE)重叠,12个与长散在重复元件(LINE)重叠,10个与长末端重复(LTR)重叠,7个与DNA重复元件重叠,2个与低拷贝重复(LCR)重叠,3个与简单重复重叠;35个断裂连接点序列中,8例含有碱基插入,24例具有1-5bp的重叠或相似,即68.6%(24/35)的病例断裂连接点具有微同源性。上述结果表明芯片分析对于克隆DMD基因断裂点高效而准确;58.6%的断裂点与散在重复元件位置重叠,比其在DMD基因的平均含量(35.6%)高,推测这些散在重复元件可能与DMD基因特定区域易于发生断裂相关;68.6%的病例断裂连接点具有微同源性,提示非同源末端连接(NHEJ)可能是DMD基因发生断裂重排的主要机制。
目的 应用Affymetrix全基因组芯片结合荧光定量PCR（quantitative real-timePCR，qPCR）技术，进行致病性DNA拷贝数变异的精细定位研究。方法以一个定位于染色体7q36的中国人遗传性三节拇指多并指综合征伴随Ⅳ型并指家系中的一例患者为研究对象。收集外周血标本，常规提取基因组DNA。应用Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array6．0芯片，将基因组DNA纯化，经过酶切、连接、扩增、标记、杂交、染色和扫描等步骤后得到原始数据，应用Affymetrix Genotyping Console3．0软件进行拷贝数分析。在经芯片分析所确定的重复范围内设计引物，采用qPCR方法进行验证，并进一步缩小断端范周、精确重复区域范围。结果将患者重复区域两断端范围由原来的113kb和33kb分别缩小到5．4kb和1．8kb，致病性DNA重复范围由原来的291～437kb精确至379～387kb。结论应用Affymetrix全基因组芯片联合qPCR技术可以实现对DNA拷贝数突变的精确、可靠的检测。
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