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中华微生物学和免疫学杂志 2010年第3期30卷 239-244页

作者：王波金疆钟毓红赵志超杨军楼永良严杰温州医学院检验医学院浙江省医学遗传学重点实验室325035 浙江大学医学院病原生物学教研室

目的研究重组创伤弧菌溶细胞素（rVvhA）诱导小鼠单核巨噬细胞（J774A．1）凋亡的作用及机制。方法MTT法、电子透射电镜、流式细胞仪结合AnnexinV-PI标记法、线粒体膜电位和caspase活性检测等方法测定rVvhA诱导J774A．1凋亡的作用。结果... 详细信息

目的研究重组创伤弧菌溶细胞素（rVvhA）诱导小鼠单核巨噬细胞（J774A．1）凋亡的作用及机制。方法MTT法、电子透射电镜、流式细胞仪结合AnnexinV-PI标记法、线粒体膜电位和caspase活性检测等方法测定rVvhA诱导J774A．1凋亡的作用。结果MTT结果显示rVvhA能够抑制J774A．1生长。2．0溶血单位（HU）／ml和3．0HU／ml的rVvhA作用J774A．18h后，透射电镜观察细胞和线粒体形态发生凋亡改变；流式细胞仪检测凋亡率分别为（7．80±0．62）％、（12．33±0．12）％，均高于正常组（3．07±0．67）％；线粒体膜电位也下降，流式细胞仪结果显示绿色荧光率分别是9．8％、39．2％。其中3．0HU／mlrVvhA作用组，caspase-3、9活性增加，并且具有时间依赖性，而caspase-8活性没有明显改变。3．0HU／mlrVvhA加caspase-3抑制剂（Ac—DEVD-FMK）或caspase-9抑制剂（Ac—LEHD-FMK）的凋亡率与3．0HU／mlrVvhA作用组相比都降低，分别为（6．23±3．95）％、（9．60±3．14）％；同时caspase-3、9活性也下降。结论rVvhA具有诱导J774A．1凋亡的生物学活性；其机制可能与依赖caspase的线粒体途径有关。

关键词：创伤弧菌溶细胞素 J774A.1 凋亡线粒体

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创伤弧菌溶细胞素融合蛋白对小鼠单核巨噬细胞产NO及其合酶的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 2010年第10期30卷 887-891页

作者：杜李梅郭雅君屠艳烨胡蝶楼永良严杰温州医学院检验医学院浙江省医学遗传学重点实验室325035 浙江大学医学院病原生物学教研室

目的研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白（rVvhA）对小鼠单核-巨噬细胞（J774A.1）产生一氧化氮（NO）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响.方法应用MTT法检测rVvhA对J774A.1增殖的抑制作用;Griess法检测NO含量;RT-PCR和免疫荧光法检测... 详细信息

目的研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白（rVvhA）对小鼠单核-巨噬细胞（J774A.1）产生一氧化氮（NO）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响.方法应用MTT法检测rVvhA对J774A.1增殖的抑制作用;Griess法检测NO含量;RT-PCR和免疫荧光法检测iNOS mRNA和蛋白表达水平.结果 0.8 HU/ml及以上浓度rVvhA可显著抑制J774A.1的增殖;在IFN-γ的辅助作用下,0.4 HU/ml的rVvhA即可诱导J774A.1产生大量NO,显著增加细胞内活性以及iNOS mRNA和蛋白表达水平.结论 rVvhA可诱导巨噬细胞产生NO和iNOS表达,在创伤弧菌的致病机制中具有重要意义.

关键词：创伤弧菌溶细胞素 J774A.1 一氧化氮诱导型一氧化氮合酶

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创伤弧菌溶细胞素融合蛋白对人Caeo-2细胞IL-8基因表达和IL-8分泌的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 2010年第1期30卷 60-65页

作者：谢旦立王波丁卉郑丽楼永良严杰温州医学院微生态学研究所浙江省医学遗传学重点实验室325035 浙江大学医学院病原生物学教研室

目的研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白（rVvhA）对人肠上皮细胞（human intestinal epithelial cell，Caco-2）IL-8基因表达的影响。方法IPTG诱导、表达、纯化、复性及Western blot鉴定rVvhA表达和纯化情况；CCK-8法检测rVvhA对Caco-2的细... 详细信息

目的研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白（rVvhA）对人肠上皮细胞（human intestinal epithelial cell，Caco-2）IL-8基因表达的影响。方法IPTG诱导、表达、纯化、复性及Western blot鉴定rVvhA表达和纯化情况；CCK-8法检测rVvhA对Caco-2的细胞毒性作用；RT—PCR检测rVvhA诱导Caco-2细胞IL-8基因的表达情况；ELISA检测Caco-2细胞培养上清IL-8的分泌情况。结果Ni^2＋-NTA亲和层析柱对rVvhA进行纯化后纯度可达95％以上；CCK-8结果显示rVvhA活性蛋白显著降低了Caco-2细胞的存活率，有效浓度为1．5HU／ml（P〈0．05）；RT—PCR结果显示，0．6HU／ml rVvhA 30 min即可诱导Caco-2细胞IL-8mRNA基因表达上调；ELISA结果显示，Caco-2细胞经rVvhA作用后，培养液上清中IL-8多肽的表达时相在4h。RT—PCR与ELISA结果皆显示，IL-8基因的转录及IL-8表达皆具有时间-剂量依赖性。结论rVvhA在转录水平上能诱导人Caco-2细胞IL-8 mRNA表达，促进IL-8的合成，在创伤弧菌引起的过度炎症反应和败血症的发生、发展中可能具有重要意义。

关键词：创伤弧菌溶细胞素人Caco-2细胞 IL-8

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小鼠FABP3基因全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

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解放军医学杂志 2010年第5期35卷 537-540页

作者：徐力致李励芸齐秋锋闻娟陈慧梅南京大学医学院医学遗传学教研室江苏省医学分子技术重点实验室南京210093

目的克隆小鼠FABP3基因的全长cDNA,构建其真核表达载体,并于COS-7细胞内表达。方法利用PCR技术扩增小鼠FABP3基因的开放阅读框序列,并在3′末端连接24bp的Flag标签,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建表达质粒pcD-NA3.1-FABP3和pcDNA3.1... 详细信息

目的克隆小鼠FABP3基因的全长cDNA,构建其真核表达载体,并于COS-7细胞内表达。方法利用PCR技术扩增小鼠FABP3基因的开放阅读框序列,并在3′末端连接24bp的Flag标签,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建表达质粒pcD-NA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并行PCR、双酶切及测序鉴定。将构建的重组质粒通过脂质体转染COS-7细胞,分别采用RT-PCR和免疫荧光法检测其FABP3mRNA及蛋白的表达情况。结果所构建的pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag重组载体可酶切出418bp的FABP3 cDNA片段和442bp的FABP3-FlagcDNA片段,经测序证实正确。转染后的COS-7细胞经RT-PCR可扩增出278bp的目的片段,且免疫荧光分析可见特异性的FABP3及Flag蛋白表达。结论构建了FABP3基因真核表达载体pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并于COS-7细胞中成功转录表达,为后续研究奠定了基础。

关键词：脂肪酸结合蛋白质类克隆,分子遗传载体 COS细胞

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习惯性流产者脆性位点检查的意义

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中国妇幼保健 2010年第17期25卷 2384-2385页

作者：慕明涛黑淑梅霍满鹏张静刘俊俊蒲力群延安大学医学院医学遗传学与细胞生物学教研室遗传学研究所陕西延安716000 延安大学生命科学学院

目的:探讨应用染色体技术诊断习惯性流产病因的意义。方法:应用常规外周血淋巴细胞染色体标本制备,G显带,镜下核型分析和染色体脆性位点表达研究。结果:318例受检者中检出异常核型40例,检出率为12.58%。其中罗伯逊易位携带者9例,平衡易... 详细信息

目的:探讨应用染色体技术诊断习惯性流产病因的意义。方法:应用常规外周血淋巴细胞染色体标本制备,G显带,镜下核型分析和染色体脆性位点表达研究。结果:318例受检者中检出异常核型40例,检出率为12.58%。其中罗伯逊易位携带者9例,平衡易位携带者31例。实验组染色体脆性位点的频率为15.28%,对照组为4.69%,两组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论:染色体异常是导致习惯性流产发生的重要原因之一,习惯性流产与染色体脆性位点频率增高有关。

关键词：染色体技术习惯性流产脆性位点

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创伤弧菌溶细胞素T和B有效联合表位的筛选与鉴定

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中国细胞生物学学报 2010年第1期32卷 109-114页

作者：王波丁卉谢旦立楼永良肖美英庞碧芳严杰温州医学院检验医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州325035 浙江大学医学院病原生物学教研室杭州310031

利用生物信息学预测技术成功筛选出含部分创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnificushemolysin,VvhA)基因片段的T细胞、B细胞联合表位Vvha1、Vvha2、Vvha3和Vvha4,通过噬菌体展示技术成功获得四段表位多肽M13KE-Vvha1、M13KE-Vvha2、M13KE-Vvah3、M13KE-Vvha4,且M13KE-Vvah2、M13KE-Vvha4抗原反应性强于M13KE-Vvha1、M13KE-Vvha3。将四种抗原性多肽经腹腔注射ICR小鼠后,利用流式细胞仪及ELISA方法检测小鼠CD4^+T淋巴细胞亚群及IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ细胞因子时发现,与M13KE-Vvha3相比,经M13KE-Vvha1、M13KE-Vvha2、M13KE-Vvha4作用的小鼠CD4^+T淋巴细胞亚群的变化更为显著。与正常组相比,该三组小鼠的IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ细胞因子分泌量的变化都具有统计学意义;而经M13KE-Vvha3作用的小鼠仅IL-4的改变具有明显统计学意义。因此本研究成功筛选出含部分VvhA片段的T细胞、B细胞联合表位Vvha2、Vvha4,从而为进一步研制多抗原肽(multipleantigenic peptide,MAP)疫苗打下基础。

关键词：创伤弧菌溶细胞素噬菌体展示 B细胞表位 T细胞表位

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膜胆固醇对重组创伤弧菌溶细胞素活性的影响

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中国细胞生物学学报 2010年第5期32卷 696-701页

作者：丁卉潘娌妮郭秋楼永良严杰伍越王福乐温州医学院检验医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州325035 浙江大学医学院病原生物学教研室杭州310031

研究膜胆固醇对重组创伤弧菌溶细胞素(recombinant Vibrio vulnificus hemolysin,rVvhA)生物学活性的影响,以进一步明确rVvhA的分子致病机制。利用甲基-β-环糊精(MβCD)可以去除细胞膜上胆固醇的能力,rVvhA作用细胞之前,细胞预先经5 mm... 详细信息

研究膜胆固醇对重组创伤弧菌溶细胞素(recombinant Vibrio vulnificus hemolysin,rVvhA)生物学活性的影响,以进一步明确rVvhA的分子致病机制。利用甲基-β-环糊精(MβCD)可以去除细胞膜上胆固醇的能力,rVvhA作用细胞之前,细胞预先经5 mmol/L MβCD处理。测定MβCD预处理组和未处理组(即rVvhA直接作用组)细胞的存活率、细胞内钙离子浓度、培养上清中钾离子浓度及细胞凋亡与坏死情况。结果显示MβCD预处理组的细胞存活率较rVvhA直接作用组高、rVvhA引起的钙离子内流和钾离子释放受到抑制、细胞凋亡率也明显降低。结果表明,在rVvhA活性发挥中细胞膜上的胆固醇是必须存在的,胆固醇的降低会抑制rVvhA的活性。

关键词：创伤弧菌溶细胞素甲基-β-环糊精胆固醇

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重组创伤弧菌溶细胞素诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的作用及其机制

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中国细胞生物学学报 2010年第1期32卷 103-108页

作者：王波丁卉谢旦立楼永良严杰杨军赵志超温州医学院检验医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州325035 浙江大学医学院病原生物学教研室杭州310031

为了研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的作用及其机制。采用MTT法、普通光学显微镜和电子透射电镜、流式细胞仪结合Annexin V-PI标记法、caspase活性检测等方法测定rVvhA诱导HUVEC凋亡的作用。结果显示r... 详细信息

为了研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的作用及其机制。采用MTT法、普通光学显微镜和电子透射电镜、流式细胞仪结合Annexin V-PI标记法、caspase活性检测等方法测定rVvhA诱导HUVEC凋亡的作用。结果显示rVvhA能够抑制HUVEC生长。3.0溶血单位(HU)/ml和4.0 HU/ml的rVvhA作用HUVEC 8 h后,细胞和线粒体的形态发生凋亡改变,其中4.0 HU/ml处理组的凋亡率(51.73±1.96)%高于对照组(3.53±0.64)%和3.0 HU/ml处理组(12.83±5.00)%,具有剂量依赖性;4.0 HU/ml rVvhA诱导HUVEC凋亡过程中,caspase-3、caspase-9活性增加,并且具有时间依赖性,而caspase-8活性没有明显改变;4.0 HU/ml rVvhA加caspase-3抑制剂Ac-DEVD-FMK或caspase-9抑制剂Ac-LEHD-FMK的凋亡率分别下降到(14.2±3.47)%、(24.93±3.93)%。同时caspase-3、caspase-9活性也下降。结果表明rVvhA具有诱导HUVEC凋亡的生物学活性;其机制可能与依赖caspase的线粒体途径有关。

关键词：创伤弧菌溶细胞素人脐静脉内皮细胞凋亡 caspase

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腓骨肌萎缩症的遗传特征及致病机制的研究进展

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国际遗传学杂志 2010年第2期33卷 93-96+124页

作者：徐汪洋孙莲花顾鸣敏上海交通大学医学院医学遗传学教研室

腓骨肌萎缩症(CCharcot-Marie-Tooth disease,CMT)是一类常见的遗传性周围神经病,发病率约为1/2500。该病主要呈AD遗传,也可呈AR遗传及XD或XR遗传。据统计,与CMT相关的基因有33个,已确定的致病基因至少有27个,其中外周髓鞘蛋白22(periph... 详细信息

腓骨肌萎缩症(CCharcot-Marie-Tooth disease,CMT)是一类常见的遗传性周围神经病,发病率约为1/2500。该病主要呈AD遗传,也可呈AR遗传及XD或XR遗传。据统计,与CMT相关的基因有33个,已确定的致病基因至少有27个,其中外周髓鞘蛋白22(peripheral myelin protein 22,PMP22)、髓鞘蛋白零(myelin protein zero,MPZ)和间隙连接蛋白32(connexin-32,Cx32)异常最受关注。近年来在突变基因特征及其致病机制方面取得的研究进展为该病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。本文主要就上述内容作一综述。

关键词：腓骨肌萎缩症突变基因致病机制

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从转录水平研究SATB1表达调控的分子机制

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现代生物医学进展 2010年第10期10卷 1805-1809页

作者：魏丹丹张洪信吴晓林黄雷顾鸣敏王铸钢上海交通大学医学院医学遗传学教研室上海200025

目的:研究SATB15’转录调控区及3’UTR的调控作用,以阐明SATB1在各肿瘤细胞系中的表达和调控机制。方法:采用半定量RT-PCR分析人乳腺癌细胞系BT549和MCF7、人肺癌细胞系NCI-H-446、QG56和SPC-A1中SATB1的转录水平,并利用Western Blot方... 详细信息

目的:研究SATB15’转录调控区及3’UTR的调控作用,以阐明SATB1在各肿瘤细胞系中的表达和调控机制。方法:采用半定量RT-PCR分析人乳腺癌细胞系BT549和MCF7、人肺癌细胞系NCI-H-446、QG56和SPC-A1中SATB1的转录水平,并利用Western Blot方法检测各肿瘤细胞系中蛋白表达水平。分别构建SATB1两个转录本5’上游序列驱动的报告基因载体,将载体瞬时转染QG56及SPC-A1。构建含SATB1基因3’非翻译区(3’UTR)的报告载体,瞬时转染NCI-H-446、QG56及SPC-A1。运用双通道荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。结果:在BT549、NCI-H-446、QG56和SPC-A1中检测到SATB1的转录本2,仅在BT549及QG56有转录本1表达;但在NCI-H-446、QG56及SPC-A1中,未检测到蛋白水平的表达。在QG56中,转录本1上游-638～+404序列段荧光素酶活性最高,而在SPC-A1中转录本2上游-1218～+48序列段的荧光素酶活性最高。运用生物信息学分析-638～+404和-1218～+48两个序列段的转录因子结合位点。在NCI-H-446中,含有SATB13’非翻译区(3’UTR)报告载体的荧光素酶活性显著低于PGL3control的活性(P<0.05)。结论:在肺癌细胞中,SATB1的表达与细胞转移能力的高低无关。RT-PCR、荧光素酶活性及生物信息学分析结果的一致表明SATB1的两个转录本分别受其5’上游序列调控。在NCI-H-446中,SATB1的表达受其3’UTR的调控。

关键词： SATB1基因启动子 3’非翻译区荧光素酶活性

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