检索结果-内蒙古大学图书馆

生物化学与生物物理学报 2003年第7期35卷 624-628页

作者：王霞李平张宇清侯敏孙兴会谭理朱运松复旦大学上海医学院分子遗传教研室复旦大学上海医学院分子遗传教研室上海200032

为了解尿激酶型纤溶酶激活物 (urokinase typeplaminogenactivator,uPA)的氨基末端片段 (amino terminalfrag ment,ATF)和纤溶酶激活物抑制剂 2 (plasminogenactivatorinhibitortype 2 ,PAI 2 )突变体PAI 2CD融合蛋白在大肠杆菌的表达情况及进一步研究其生物学活性、将ATF PAI2CD融合基因与大肠杆菌表达载体pLY 4重组得到表达质粒pZWE ATF PAI2CD ,以其转化大肠杆菌JF112 5 ,经温度诱导 ,ATF PAI2CD获得较高水平表达 ,融合蛋白质以包涵体形式存在 ,占菌体总蛋白质的 15 %。包涵体经洗涤、8mol L尿素溶解、稀释复性及离子交换色谱一步分离 ,纯度达 90 % ,分子量与理论值相符。每升发酵液得重组融合蛋白质 5 0mg。经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性 ,比活性达 12 0 0 0IU mg ;应用放射竞争法证实融合蛋白质能与肿瘤细胞表面的uPA受体特异性结合。双功能融合蛋白质的纤溶抑制活性与野生型PAI 2 (或PAI 2突变体 ,PAI 2CD)基本一致 ,与肿瘤细胞表面的uPA受体的结合能力同pro uPA。

关键词：融合蛋白质表达纯化放射竞争抑制实验

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腺病毒介导的uPAR反义核酸转移抑制肿瘤细胞的侵袭

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生物化学与生物物理进展 2003年第5期30卷 761-766页

作者：孙兴会谭理李平张宇清王霞侯敏宋后燕朱运松复旦大学上海医学院分子遗传教研室

为了观察尿激酶受体(uPAR)反义核酸对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用,用PCR方法扩增uPARcDNA 5′端 -4 6bp～ +45 4bp一段长 5 0 0bp的序列,利用DNA重组技术将其克隆到病毒载体pAdeno X中,构建出重组腺病毒载体pAdeno X uPAR( - )和pAdeno ... 详细信息

为了观察尿激酶受体(uPAR)反义核酸对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用,用PCR方法扩增uPARcDNA 5′端 -4 6bp～ +45 4bp一段长 5 0 0bp的序列,利用DNA重组技术将其克隆到病毒载体pAdeno X中,构建出重组腺病毒载体pAdeno X uPAR( - )和pAdeno X uPAR( +).线性化后的重组腺病毒载体转染HEK2 93细胞 7天后,可以获得滴度分别为 1 5× 10 8pfu/ml和 0 5× 10 8pfu/ml的uPAR反义和正义核酸表达重组腺病毒,分别命名为Ad uPAR( -)和Ad uPAR( +).以不同的病毒感染指数(MOI)感染人肺巨细胞癌高转移株 95D肿瘤细胞,3天后用RNA印迹法可以检测肿瘤细胞uPAR正义和反义核酸表达水平,随着MOI的升高,Ad uPAR( - )感染的肿瘤细胞uPAR蛋白水平逐渐下降,肿瘤细胞的体外侵袭能力也明显下降,而感染Ad uPAR( +)的肿瘤细胞无明显变化.结果表明,重组腺病毒可以表达uPAR正义和反义核酸,uPAR反义核酸可以明显抑制人肺巨细胞癌高转移株 95D肿瘤细胞在体外的侵袭能力.

关键词：腺病毒介导反义核酸抑制肿瘤细胞腺病毒尿激酶受体

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可溶性组织因子突变体的基因构建、表达和性质

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第3期34卷 347-352页

作者：于敏张宇杲王羽雄宋后燕复旦大学医学院分子遗传教研室上海200032 复旦大学医学院分子遗传教研室

血浆中组织因子 (TF)的过量表达与许多病理过程密切相关。TF抑制物有可能防治这些疾病。设计了两种可溶性组织因子 (sTF)的突变体 (MCsTF和MFsTF) ,突变了协同催化的功能域 ,保留与因子VII/VIIa结合的功能域 ,使突变体竞争性抑制野生型T... 详细信息

血浆中组织因子 (TF)的过量表达与许多病理过程密切相关。TF抑制物有可能防治这些疾病。设计了两种可溶性组织因子 (sTF)的突变体 (MCsTF和MFsTF) ,突变了协同催化的功能域 ,保留与因子VII/VIIa结合的功能域 ,使突变体竞争性抑制野生型TF的功能。用PCR的方法 ,对可溶性组织因子cDNA基因进行了点突变 ,并实现了在大肠杆菌中高效表达。rsTF、rMCsTF和rMFsTF的促凝活性研究表明 ,rMFsTF的激活X因子活性和促凝血作用相当于rsTF的 10 % ,而rMCsTF几乎完全失去了激活X因子活性和促凝血作用。rMCsTF和rMFsTF与VII/VIIa因子形成复合物对激活X因子的催化特异常数 (kcat/Km)分别是FVII/VIIa·rsTF的 2 .0 %和 3.7% ,也说明突变体与VII/VIIa形成的复合物对激活X因子催化活性显著降低。rMCsTF和rMFsTF对rsTF活性抑制动力学研究及体外活性研究表明 ,两种突变体均有抑制rsTF活性和抑制兔脑粉的促凝活性作用 ,抑制作用呈量效关系

关键词：可溶性组织因子突变体外源性凝血途径活性抑制

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Miyabenol C和Kobophenol A与雌激素受体的结合位点

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第1期35卷 77-81页

作者：田春艳高海东张宇杲徐光胡昌奇宋后燕复旦大学药学院天然药化教研室山东大学齐鲁医院普外科复旦大学上海医学院分子遗传教研室上海200032 复旦大学上海医学院分子遗传教研室济南250012

iyabenolC (MiyC)和kobophenolA (KobA)是两种新型的植物雌激素。为了探讨MiyC和KobA与雌激素受体 (ER)的结合部位 ,运用计算机辅助分子模拟构建它们与ER结合的空间模型 ,找出结合位点 ,设计ER的两个突变体M1ER(ERM517AG52 1D)和M2ER(ER... 详细信息

iyabenolC (MiyC)和kobophenolA (KobA)是两种新型的植物雌激素。为了探讨MiyC和KobA与雌激素受体 (ER)的结合部位 ,运用计算机辅助分子模拟构建它们与ER结合的空间模型 ,找出结合位点 ,设计ER的两个突变体M1ER(ERM517AG52 1D)和M2ER(ERE353GR394 G) ;运用PCR技术将ER与MiyC或KobA的结合位点进行突变 ;运用报告基因检测实验 ,检测MiyC和KobA对突变的ER是否具有激活功能。结果显示MiyC激活M1ER使之促下游基因转录的作用下降 ,KobA对M1ER无激活作用 ;MiyC和KobA对M2ER无激活作用。以上结果显示MiyC和KobA与ER的结合位点可能为ER的Glu353 、Arg394 、Met517和Gly52 1。

关键词：雌激素受体结合位点植物雌激素

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PAI-2与IRF-3相互作用的鉴定(英文)

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第7期35卷 661-665页

作者：张宇清李平侯敏王霞樊静谭理朱运松复旦大学上海医学院分子遗传学教研室教育部分子医学重点实验室上海200032 复旦大学上海医学院分子遗传学教研室

2型纤溶酶原激活物抑制剂 (plasminogenactivatorinhibitortype 2 ,PAI 2 )除了参与纤溶活性的调节、肿瘤的浸润和迁移外 ,在抑制细胞凋亡方面也发挥着重要作用。现已明确 ,PAI 2分子中的CD螺旋间区是PAI 2与其他蛋白质相互作用的结构... 详细信息

2型纤溶酶原激活物抑制剂 (plasminogenactivatorinhibitortype 2 ,PAI 2 )除了参与纤溶活性的调节、肿瘤的浸润和迁移外 ,在抑制细胞凋亡方面也发挥着重要作用。现已明确 ,PAI 2分子中的CD螺旋间区是PAI 2与其他蛋白质相互作用的结构域 ,该区的缺失将直接导致PAI 2丧失对TNF α诱导细胞凋亡的拮抗功能 ,但其作用机制不详。以PAI 2的CD螺旋间区为诱饵 ,利用Gal 4酵母双杂交系统筛选凋亡过程中的HeLa细胞cDNA文库 ,发现干扰素调节因子 3(interferonregulatoryfactor 3,IRF 3)C端的 98个氨基酸残基与PAI 2的CD螺旋间区之间存在相互作用。通过RT PCR获得IRF 3的全长cDNA。免疫共沉淀实验进一步证实PAI 2通过其CD螺旋间区与IRF 3在细胞内也存在特异性的相互作用。IRF 3是一种转录调节因子 ,在抗病毒感染、免疫调节、病毒诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。因此证实PAI 2与IRF 3之间存在相互作用 ,为进一步研究PAI 2参与抗病毒感染或抗细胞凋亡等方面打下了基础

关键词： 2型纤溶酶原激活物抑制剂干扰素调节因子3 酵母双杂交免疫共沉淀

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ATF-PAI2CD融合蛋白基因在毕赤酵母中克隆、表达和鉴定

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中国生物化学与分子生物学报 2004年第1期20卷 61-66页

作者：王霞侯敏孙兴会张宇清李平谭理朱运松复旦大学上海医学院分子遗传教研室

为了克隆尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)的氨基末端片段与纤溶酶原激活剂抑制物 2型(PAI 2 )突变体所构成的融合蛋白基因 ,并在Pichiapastoris中表达 ,应用PCR获得了人ATF PAI2CD融合蛋白基因cDNA(简称ATF PAI2CD) ,将其克隆到酵母表达载... 详细信息

为了克隆尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)的氨基末端片段与纤溶酶原激活剂抑制物 2型(PAI 2 )突变体所构成的融合蛋白基因 ,并在Pichiapastoris中表达 ,应用PCR获得了人ATF PAI2CD融合蛋白基因cDNA(简称ATF PAI2CD) ,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K ,获得融合基因表达质粒pZWY ATF PAI2CD .该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,然后用甲醇诱导表达 .工程菌用摇瓶发酵 ,表达产物ATF PAI2CD占培养液中总蛋白 5 0 %以上 .经硫酸铵沉淀、分子筛和离子交换层析纯化得到的目标表达产物纯度达 95 % .Western印迹检测具有PAI 2与uPA的免疫原性 ,经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性 .经流式细胞仪 (FCM )检测 ,能与肿瘤细胞特异性结合 .结果表明 ,ATF PAI2CD融合蛋白成功地在毕赤酵母中表达 ,且具有抑制uPA及与肿瘤细胞表面uPAR特异性结合的双重功能 .提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景 .

关键词： ATF-PAI2CD 融合蛋白基因毕赤酵母克隆表达鉴定尿激酶型纤溶酶原激活物

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重组人血管内皮细胞生长因子121cDNA的基因克隆、表达和鉴定

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生物化学与生物物理进展 2002年第3期29卷 444-448页

作者：王跃祥官孝群杨健莫炜宋后燕复旦大学医学院分子遗传教研室上海200032

应用RT PCR方法 ,扩增人VEGF12 1cDNA基因片段 ,与酵母表达载体pPIC9K重组 ,获得表达质粒p9KVEGF12 1.该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,PCR鉴定VEGF12 1cDNA与酵母染色体整合状态 ,高拷贝转化子用甲醇诱... 详细信息

应用RT PCR方法 ,扩增人VEGF12 1cDNA基因片段 ,与酵母表达载体pPIC9K重组 ,获得表达质粒p9KVEGF12 1.该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,PCR鉴定VEGF12 1cDNA与酵母染色体整合状态 ,高拷贝转化子用甲醇诱导表达 .工程菌用 5L发酵罐发酵 ,表达产物r hVEGF12 1占培养液中总蛋白量 70 %以上 .纯化产物促进牛毛细血管内皮 (BCE)细胞增殖。

关键词：重组人血管内皮细胞生长因子121 cDNA 基因克隆表达鉴定血管生成血管通透毕赤酵母

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Lys_(10)-PAI-1融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和凝胶阻滞实验

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中国生物化学与分子生物学报 2003年第4期19卷 457-462页

作者：孙兴会李平张宇清谭理王霞侯敏陈怡韵朱运松复旦大学上海医学院分子遗传教研室上海200032

用PCR方法构建 10个赖氨酸与纤溶酶原激活剂抑制物 1的融合基因Lys10 PAI 1,并克隆于pET2 8a(+ )和pET32a(+ )原核表达载体 .将重组表达质粒pET32 PAI和pET2 8 PAI转化大肠杆菌BL2 1(DE3) .IPTG诱导后可获得分子量分别为 6 3kD和 4 ... 详细信息

用PCR方法构建 10个赖氨酸与纤溶酶原激活剂抑制物 1的融合基因Lys10 PAI 1,并克隆于pET2 8a(+ )和pET32a(+ )原核表达载体 .将重组表达质粒pET32 PAI和pET2 8 PAI转化大肠杆菌BL2 1(DE3) .IPTG诱导后可获得分子量分别为 6 3kD和 4 3kD的目的蛋白 ,表达蛋白占菌体蛋白2 0 %以上 ,大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物经变性、复性、超滤、透析和亲和层析等步骤 ,可以得到纯化的Trx·PAI 1和rPAI 1重组蛋白 .Western印迹结果表明 ,目的蛋白具有人PAI 1的抗原性 .凝胶阻滞实验发现 ,纯化的重组蛋白在一定条件下 ,可以与质粒结合 ,使质粒的迁移率明显改变 .研究结果表明 ,Trx·PAI 1和rPAI

关键词：纤溶酶原激活剂抑制物-1 融合基因凝胶阻滞表达纯化

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阳性表达表皮钙粘蛋白增加G0/G1期人乳腺癌细胞比例及其分子机制

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生物化学与生物物理进展 2003年第3期30卷 435-441页

作者：吴衡沈敏雄梁玉龙段玲玲王丽影徐贞查锡良复旦大学上海医学院生化与分子生物学教研室上海200032

表皮钙粘蛋白 (E cadherin)阴性的乳腺癌细胞株MDA MB 2 3 1和MDA MB 43 5转染野生型表皮钙粘蛋白基因 ,通过流式细胞仪测量细胞周期发现表皮钙粘蛋白阳性细胞生长变慢 ,更多细胞停滞在G0 /G1期 ,蛋白质印迹证实由G0 /G1期进入S期的重... 详细信息

表皮钙粘蛋白 (E cadherin)阴性的乳腺癌细胞株MDA MB 2 3 1和MDA MB 43 5转染野生型表皮钙粘蛋白基因 ,通过流式细胞仪测量细胞周期发现表皮钙粘蛋白阳性细胞生长变慢 ,更多细胞停滞在G0 /G1期 ,蛋白质印迹证实由G0 /G1期进入S期的重要调控分子细胞周期蛋白 D1(cyclinD1)下降了 ,并发现表皮钙粘蛋白还能降低直接激活细胞周期蛋白 D1基因转录的 β 连环蛋白的蛋白质浓度 .蛋白激酶B (PKB)能通过抑制糖原合成激酶 3 β(GSK 3 β)的活性来抑制β 连环蛋白降解 ,并在乳腺癌高转移细胞株中普遍过表达 ,其表达同样受到了表皮钙粘蛋白的抑制 .并且在表皮钙粘蛋白阳性细胞中 ,作为PKB上游信号分子并能激活PKB的粘着斑激酶 (FAK)和整联蛋白相关激酶 (ILK)蛋白量也发生下降 ,能抑制PKB激活的PTEN蛋白量却增加了 .结果显示 ,表皮钙粘蛋白能通过降低乳腺癌细胞中的PKB蛋白浓度 ,并通过上游信号分子抑制PKB的激活 ,进而降低PKB对β 连环蛋白降解的抑制作用 ,导致 β 连环蛋白直接调控的靶基因细胞周期蛋白D1的表达量下降 ,引起更多的细胞停止在G0

关键词：表皮钙粘蛋白 G0/G1期人乳腺癌细胞分子机制细胞周期蛋白D1 蛋白激酶B

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葡萄糖调节蛋白75对缺糖诱导的凋亡相关基因Bax和NF-κB改变的影响

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解剖学报 2009年第4期40卷 594-598页

作者：杨玲赵明霞刘雯刘晓宇郝金玉左伋复旦大学上海医学院细胞与遗传医学教研室

目的通过已获得稳定表达葡萄糖调节蛋白（Grp75）的PC12细胞株,检测Grp75对缺糖诱导的细胞凋亡过程中Bax和NF-κB的影响。方法Grp75过表达组和对照组细胞无糖培养6h、12h2、4h和48h后,进行相关的实验。免疫印迹法检测缺糖状态下两组细胞... 详细信息

目的通过已获得稳定表达葡萄糖调节蛋白（Grp75）的PC12细胞株,检测Grp75对缺糖诱导的细胞凋亡过程中Bax和NF-κB的影响。方法Grp75过表达组和对照组细胞无糖培养6h、12h2、4h和48h后,进行相关的实验。免疫印迹法检测缺糖状态下两组细胞中Grp75的表达水平和NF-κB的活性;应用半定量RT-PCR和免疫印迹法比较Bax表达水平的变化;免疫细胞化学通过构象特异性的Bax 6A7抗体检测Bax的活化。结果Bax活化和NF-κB活性的下降在缺糖诱导的PC12细胞凋亡过程中发挥了重要的作用。而Grp75通过阻止Bax的活化和NF-κB活性的下降抑制缺糖诱导的凋亡。缺糖状态下Grp75过表达组和对照组细胞中Bax表达水平均未发生改变。结论Bax活化和NF-κB活性下降与缺糖诱导的PC12细胞凋亡关系密切,Grp75通过阻止Bax的活化和维持NF-κB的活性保护PC12细胞。

关键词：葡萄糖调节蛋白75 Bax NF-κB 缺糖免疫印迹法

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