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中华微生物学和免疫学杂志 2014年第10期34卷 798-802页

作者：王蕾马丽俐孙桂芹李蒙策力木格陈力复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室 200032 浙江中医药大学附属第一医院杭州340006

1987年在大肠杆菌K12的碱性磷酸酶（ iap）基因的3′侧翼区首先发现了一类具有短回文特质的DNA重复序列［1］。2002年，这类结构被正式命名为成簇恒间隔短回文重复序列（CRISPR），CRISPR关联蛋白也同时得以命名［2］。2005年，3个研究... 详细信息

1987年在大肠杆菌K12的碱性磷酸酶（ iap）基因的3′侧翼区首先发现了一类具有短回文特质的DNA重复序列［1］。2002年，这类结构被正式命名为成簇恒间隔短回文重复序列（CRISPR），CRISPR关联蛋白也同时得以命名［2］。2005年，3个研究课题组同时发现间隔序列可能源自于细菌染色体外的其他遗传物质，如噬菌体和接合质粒，并推论CRISPR／Cas系统可以抵制入侵的外源 DNA［3-5］。2007年，来源于侵染噬菌体的新的整合间隔序列得到实验验证；研究同时建立了新获得的间隔序列与细菌抵抗该噬菌体侵袭的直接关联关系，证明了CRISPR／Cas系统是抵抗噬菌体的获得性免疫系统［6］。 Marraffini和Sontheimer［7］证实CRISPR／Cas系统对于接合现象和质粒转化的干扰作用。最近基于CRISPR／Cas作用机制的研究，发现了其在细菌毒力、致病性以及如何逃避宿主免疫系统等方面的相关作用［8］。

关键词： Cas系统回文序列蛋白系统成簇 DNA重复序列大肠杆菌K12 Ⅱ型细菌染色

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组织细胞DNA含量变化与死亡时间的相关性研究

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法医学杂志 2005年第2期21卷 115-117页

作者：陈新沈忆文顾云菊刘志萍孙淑惠赵子琴上海市刑事科学技术研究所上海200083 复旦大学上海医学院法医学系上海200032 复旦大学上海医学院卫生部医学分子病毒学重点实验室上海200032

目的研究人死后各器官组织细胞DNA降解变化规律,探讨其在推断死亡时间方面的应用价值,为推断死亡时间提供科学依据。方法已知死亡时间人尸体的心、肝、脾、肾,按死后6,12,24和48h四个时间段取材,制成石蜡切片,经Feulgen染色并图像分析;... 详细信息

目的研究人死后各器官组织细胞DNA降解变化规律,探讨其在推断死亡时间方面的应用价值,为推断死亡时间提供科学依据。方法已知死亡时间人尸体的心、肝、脾、肾,按死后6,12,24和48h四个时间段取材,制成石蜡切片,经Feulgen染色并图像分析;同时将各器官组织按不同时间段取材,制成单细胞悬液,应用流式细胞仪检测DNA含量。结果(1)人体各器官组织细胞经FCM检测,脾细胞核DNA随死亡时间延长呈现较好的下降梯度,而心、肝、肾,则由于自溶较快,死后6h细胞核DNA含量已很低,其变化情况与死亡时间的相关性不佳;(2)各器官组织细胞核DNA染色强度指数均随死亡时间的延长而下降。结论(1)机体死亡后,各器官组织细胞核DNA含量随死亡时间延长逐渐减少,具有一定的变化规律,其中以脾细胞核DNA含量的变化趋势与死亡时间最具相关性,肝、肾次之,而心最差;(2)方法学分析,图像分析技术(IAT)与流式细胞术(FCM)两种检测方法在研究组织细胞DNA含量变化方面,各有利弊,可互补不足。

关键词：组织细胞DNA 死亡时间含量变化相关性研究细胞核DNA含量流式细胞术(FCM) Feulgen染色流式细胞仪检测图像分析技术变化规律时间延长器官组织 DNA降解单细胞悬液 FCM检测 DNA染色方法学分析应用价值科学依据

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肝癌患者肝组织中2.2kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体结构及功能的研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2002年第1期16卷 11-15页

作者：林旭闻玉梅万大方钱耕荪顾健人复旦大学医学院卫生部医学分子病毒学重点实验室上海200032 上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室

目的　研究肝癌患者肝组织中 2 2kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体的结构和功能。方法　PCR扩增 12对肝癌组织及癌旁肝组织中的乙型肝炎病毒 (HepatitisBvirus,HBV)全基因组。克隆 3 2kb全长HBV基因组及 2 2kb剪接变异体基因组 ,测序... 详细信息

目的　研究肝癌患者肝组织中 2 2kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体的结构和功能。方法　PCR扩增 12对肝癌组织及癌旁肝组织中的乙型肝炎病毒 (HepatitisBvirus,HBV)全基因组。克隆 3 2kb全长HBV基因组及 2 2kb剪接变异体基因组 ,测序并比较它们基因结构的差异。将 2 2kbHBV剪接体基因组与全长基因组共同转染HepG2 细胞 ,分别以HBV全长基因组特异性引物及剪接变异体特异性引物对转染后细胞内HBV核心颗粒进行PCR检测 ,以判定 2 2kbHBV剪接变异体对全长HBV复制功能的影响。结果　 2 2kbHBV基因组剪接变异体见于所有的癌组织及癌旁组织。相同模板量获得的扩增产物进行图象扫描分析 ,发现癌组织中 2 2kbHBV基因组剪接变异体与全长HBV的比值高于癌旁组织。序列分析表明 ,2 2kbHBV剪接变异体保留 5′端包装信号以及与完整的X基因、C及preC基因。细胞转染结果显示 ,加入 2 2kb剪接变异体共转染 ,细胞中 3 2kb全长HBV基因组的复制量可增强 3～ 7倍。结论　肝组织内普遍存在 2 2kbHBV基因组剪接变异体 ,该变异体在癌组织中的相对量高于癌旁组织。 2 2kbHBV基因组剪接变异体可使全长HBV基因组复制增强 ,提示可能与肝癌的发生。

关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接聚合酶链反应肝癌

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志贺菌属致病的研究进展

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国外医学（微生物学分册） 2004年第6期27卷 22-24页

作者：唐传玲瞿涤复旦大学上海医学院教育部医学分子病毒学实验室复旦大学上海医学院卫生部医学分子病毒学实验室

致病岛是指细菌染色体上具有典型结构特征的基因片段,主要编码细菌毒力及代谢相关产物.志贺菌属基因组中已发现了多个致病岛,并广泛存在于该菌属的各群细菌中,与致病性和耐药性等密切相关.对志贺菌属致病岛的研究为进一步深入理解其致... 详细信息

致病岛是指细菌染色体上具有典型结构特征的基因片段,主要编码细菌毒力及代谢相关产物.志贺菌属基因组中已发现了多个致病岛,并广泛存在于该菌属的各群细菌中,与致病性和耐药性等密切相关.对志贺菌属致病岛的研究为进一步深入理解其致病机制、开发防治细菌性痢疾的新策略提供了理论依据.

关键词：志贺菌属致病机制细菌染色体研究进展细菌性痢疾耐药性基因片段毒力致病性代谢

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质粒介导16S rRNA甲基化酶肺炎克雷伯菌临床分离株的检测及分子流行病学研究

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中华检验医学杂志 2009年第3期32卷 268-273页

作者：余方友陈婵杜卫良李国安张雪青陈增强陈坚王良兴朱涛瞿涤温州医学院附属第一医院检验科 325000 温州医学院附属第一医院呼吸科 325000 复旦大学上海医学院教育部卫生部医学分子病毒学重点实验室

目的调查16SrRNA甲基化酶在肺炎克雷伯菌临床分离株中的流行情况。方法收集我院2006年1月至2007年9月从临床标本中分离的肺炎克雷伯菌337株，所有菌株均为非重复株。菌种鉴定采用全自动微生物分析仪，庆大霉素、阿米卡星和妥布霉素的药... 详细信息

目的调查16SrRNA甲基化酶在肺炎克雷伯菌临床分离株中的流行情况。方法收集我院2006年1月至2007年9月从临床标本中分离的肺炎克雷伯菌337株，所有菌株均为非重复株。菌种鉴定采用全自动微生物分析仪，庆大霉素、阿米卡星和妥布霉素的药敏试验采用琼脂稀释法。超广谱B内酰胺酶（ESBLs）检测采用美国临床和实验室标准协会（CLSI）规定的纸片确证法。使用PCR检测16SrRNA甲基化酶基因、整合酶基因和ESBL基因。接合试验检测质粒的可转移性；脉冲场电泳分析菌株的同源性。结果337株肺炎克雷伯菌对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐药率分别为19．0％（64／337）、8．3％（28／337）和16．3％（55／337）。21株16SrRNA甲基化酶基因阳性，阳性率为6．2％（21／337），其中13株rmtB阳性、3株armA阳性、5株rmtB和armA同时阳性。所有16SrRNA甲基化酶基因阳性株对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星同时耐药且都为高度耐药（MICs≥256彬L），21株甲基化酶基因阳性株有19株产ESBLs，ESBL基因主要为CTX-M-14-like、CTX-M-15-like和SHV．12-like。21株均为Ⅰ类整合酶基因阳性。13株通过接合试验把质粒传递给受体菌***53。所有接合子Ⅰ类整合酶基因阳性、blaTEM-1基因阳性、产ESBLs及对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星和复方磺胺甲略唑耐药，对其他抗菌药物敏感。接合子ESBL基因型与供菌一致。21株16SrRNA甲基化酶基因阳性株经脉冲场凝胶电泳（PFGE）分成14个基因型，主要为A型和I型。结论armA和rmtB型16SrRNA甲基化酶基因已经在肺炎克雷伯菌中播散，既可通过克隆株播散也可通过接合性质粒在不同菌株间播散。

关键词：克雷伯菌,肺炎 RNA,核糖体,16S 甲基转移酶类质粒

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活细胞成像技术实时追踪荧光蛋白标记的分枝杆菌的胞内增殖

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复旦学报（医学版） 2014年第3期41卷 384-388页

作者：乔可王晴岚李紫煜牛辰复旦大学基础医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室上海200032 北京东胜创新生物科技有限公司分子影像部北京100085

目的利用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记和活细胞显微成像的方法,实时追踪分枝杆菌在巨噬细胞内的增殖过程。方法用经GFP标记的野生型海分枝杆菌（Mycobacterium marinum,Mm）分别侵染未激活和γ-干扰素激活的巨... 详细信息

目的利用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记和活细胞显微成像的方法,实时追踪分枝杆菌在巨噬细胞内的增殖过程。方法用经GFP标记的野生型海分枝杆菌（Mycobacterium marinum,Mm）分别侵染未激活和γ-干扰素激活的巨噬细胞,使用活细胞显微成像系统连续记录胞内分枝杆菌的增殖动态,同时优化不同细胞接种浓度和感染复数（multiplicity of infection,MOI）对胞内菌增殖动态的追踪效果。结果使用GFP标记和活细胞成像的方法可以实时追踪胞内分枝杆菌的增殖过程和形态学变化。γ干扰素对Mm在巨噬细胞中的增殖有抑制作用。当接种巨噬细胞浓度为1×105/孔,MOI为1时,可直观清晰地分析实时追踪图像中胞内菌的增殖过程。结论通过活细胞成像技术分析荧光蛋白标记的分枝杆菌,可实时追踪巨噬细胞内分枝杆菌增殖过程和形态学变化,是一种体外分析胞内分枝杆菌增殖的理想方法,可应用于其他相关病原菌和宿主相互作用及影响因素的研究。

关键词：海分枝杆菌(Mm) 巨噬细胞活细胞成像细菌增殖感染复数(MOI)

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葡萄糖对表皮葡萄球菌生物被膜形成的影响及调节机制的研究

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微生物学报 2005年第3期45卷 431-436页

作者：靳嘉巍张力查锡良李华林瞿涤复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系卫生部糖复合物重点实验室上海200032 复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系卫生部糖复合物重点实验室室上海200032 复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系教育部医学分子病毒学重点实验室上海200032

生物被膜(Biofilm)是条件致病菌表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的主要致病因素,生物被膜的形成依赖多糖PIA合成,合成PIA的糖基转移酶由icaADBC基因编码。以生物被膜形成能力不同的菌株为对象,通过研究不同环境对生物被膜形成... 详细信息

生物被膜(Biofilm)是条件致病菌表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的主要致病因素,生物被膜的形成依赖多糖PIA合成,合成PIA的糖基转移酶由icaADBC基因编码。以生物被膜形成能力不同的菌株为对象,通过研究不同环境对生物被膜形成、细菌总糖量及相关基因表达的变化,探索外界环境对生物被膜形成的影响及葡萄糖对生物被膜诱导的分子机制。有利于生物被膜形成培养条件促进生物被膜形成及多糖的表达,葡萄糖能诱导ica基因的表达和生物被膜形成,ica基因的反义寡核苷酸(ODN)能对抗葡萄糖的作用;葡萄糖作用下不同生长周期生物被膜形成相关基因ica、icaR、AtlE表达不同。表皮葡萄球菌生物被膜的形成与细菌糖代谢有关,葡萄糖通过上调ica表达诱导生物膜形成,但不需要ica基因的持续表达;

关键词：表皮葡萄球菌生物被膜多聚β-1 6-2脱氧-2-氨基-D-吡喃葡萄糖(PLA) 反义寡核苷酸(ODN) ica AtlE

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结核分枝杆菌散在分布重复单位基因型分型法的应用研究

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中华结核和呼吸杂志 2005年第5期28卷 292-296页

作者：沈国妙查佳徐琳孙斌桂晓红王奕峰梅建高谦复旦大学上海医学院教育部医学分子病毒学重点实验室 200032 上海市疾病预防控制中心结核病防治科

目的建立结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterialinterspersedrepetitiveunits,MIRU)基因型分型法,评估该方法在我国应用的可行性。方法采用简单数字表法随机抽取上海地区2000年至2002年保存的菌株,对其进行MIRU分型,并与间隔区寡... 详细信息

目的建立结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterialinterspersedrepetitiveunits,MIRU)基因型分型法,评估该方法在我国应用的可行性。方法采用简单数字表法随机抽取上海地区2000年至2002年保存的菌株,对其进行MIRU分型,并与间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping)的结果进行比较。结果用Spoligotyping方法对随机抽样的91株临床菌株进行基因型分型,得到20种基因型,其中81株(89%)属于北京基因型菌株,而用MIRU分型方法可将这些菌株分为46种基因型。81株北京基因型菌株可以分为39种不同的MIRU基因型。12个MIRU位点的多态性分析表明各位点有较大的区别,其中位点26显示了较高的多态性,位点16、31、40显示了中等程度的多态性。结论MIRU分型方法简单快速,其数字化结果清晰可靠,是一种有效的结核分枝杆菌基因型分型方法。

关键词：结核分枝杆菌分型法 Spoligotyping 分布分型方法 2002年 2000年基因型分型多态性分析上海地区寡核苷酸临床菌株随机抽样位点数字表间隔区数字化北京显示

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原发性耐药是耐药结核病产生的重要原因

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中华结核和呼吸杂志 2006年第2期29卷 75-78页

作者：梅建薛桢沈鑫沈国妙桂晓红沈梅高谦上海市疾病预防控制中心结核病防制科 200336 复旦大学上海医学院教育部医学分子病毒学重点实验室

目的研究原发性耐药在产生耐药结核病中的作用。方法对上海市疾病预防控制中心收集保存的1996年至2004年结核分枝杆菌临床菌株进行分析统计,计算原发性耐药和获得性耐药的比例;并对16例复发耐药患者前后发病菌株进行结核分枝杆菌散在分... 详细信息

目的研究原发性耐药在产生耐药结核病中的作用。方法对上海市疾病预防控制中心收集保存的1996年至2004年结核分枝杆菌临床菌株进行分析统计,计算原发性耐药和获得性耐药的比例;并对16例复发耐药患者前后发病菌株进行结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterialinterspersedrepetitiveunits,MIRU)基因型比较分析。结果在保存的初治患者的8120株结核分枝杆菌中,耐药菌株707株,耐药率为8.7%;复治患者的菌株610株,耐药菌株150株,耐药率为24.6%。初治和复治患者中耐药率均有上升趋势。以初治患者耐药代表原发性耐药,复治患者耐药代表获得性耐药,其原发性耐药占总耐药菌株的82.5%。在16例复发耐药患者中,13例患者在两次发病时分离的菌株基因型不一致,可能是由于重新感染了耐药菌株所致,属于原发性耐药。结论原发性耐药是目前耐药结核病产生的重要原因,该结果提示有效控制结核病的传染源是减少耐药结核病产生的关键。

关键词：分枝杆菌, 结核结核, 抗多种药物性基因型

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利用结核分枝杆菌基因型分型技术研究外源性再感染在结核病复发中的作用

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中华结核和呼吸杂志 2006年第2期29卷 79-82页

作者：沈国妙薛桢沈鑫桂晓红王奕峰孙斌沈梅梅建高谦复旦大学上海医学院教育部医学分子病毒学重点实验室 200032 上海市疾病预防控制中心结核病防制科

目的研究外源性再感染在结核病复发中的作用。方法以上海地区1999年1月至2004年3月复发肺结核患者为对象,通过比较复发肺结核患者前后两次发病时结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterialinterspersedrepetitiveunits,MIRU)基因型的... 详细信息

目的研究外源性再感染在结核病复发中的作用。方法以上海地区1999年1月至2004年3月复发肺结核患者为对象,通过比较复发肺结核患者前后两次发病时结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterialinterspersedrepetitiveunits,MIRU)基因型的差异,判断结核病复发的原因。结果在37例符合要求的结核病复发患者中,25例患者两次发病时MIRU基因型发生了变化,提示68%的结核病患者复发是由于外源性再感染而引起的。随着年龄的增加,结核病复发患者中由外源性再感染所致的可能性逐步降低,≤30岁、31～60岁、≥61岁患者中外源性再感染的比例分别为3/3、73%(11/15)、58%(11/19)。随着复发间隔时间的延长,结核病复发患者中由外源性再感染所致的可能性逐步增加,6个月内复发的患者中58%(7/12)是由外源性再感染引起的,而1年以后这个比例达到79%(11/14)。结论外源性再感染是上海地区结核病复发的重要原因;MIRU分型方法是研究结核病复发原因的可行方法。

关键词：结核复发内源性复燃外源性再感染

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