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生命科学 2010年第11期22卷 1097-1101页

作者：赵超田晓晨闻玉梅复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室复旦大学生物医学研究院上海200032

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)持续阳性是控制乙肝中难以解决的重大问题。本研究通过揭示HBsAg致病机制的基础研究,寻找抑制或清除HBsAg的新途径。通过建立有可比性的HBsAg转基因鼠和稳定表达细胞系及相应对照,进行比较转录组学和蛋白质组学... 详细信息

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)持续阳性是控制乙肝中难以解决的重大问题。本研究通过揭示HBsAg致病机制的基础研究,寻找抑制或清除HBsAg的新途径。通过建立有可比性的HBsAg转基因鼠和稳定表达细胞系及相应对照,进行比较转录组学和蛋白质组学研究,发现了HBsAg在HBV慢性感染中的一些新致病机制。其中包括:HBsAg促进肝细胞内CypA分泌,后者可趋化炎症细胞在HBsAg阳性灶周围浸润;在细胞模型中,HBsAg分泌可引起胞内GRP78蛋白下降,导致肝细胞抗凋亡能力减弱;发现HBsAg在细胞中可上调截短的LEF1基因的表达,缺乏活化全长LEF1促成瘤和增殖活性;而肝癌组织中LEF1则倾向于核内分布,并活化Wnt下游基因Cyclin D1与c-myc,有促肿瘤活性。在转基因鼠和细胞模型中都发现了物质和能量代谢相关的基因发生变化,并与临床慢性乙肝患者表现相符。研究中有关CypA的发现提供了抑制HBsAg的新途径;有关代谢的变化提出了改变饮食内容与习惯可能有利于HBsAg阳性感染者的预后。

关键词：乙肝病毒表面抗原致病机制慢性感染

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胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸对慢性支气管哮喘小鼠气道重塑的影响

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中华结核和呼吸杂志 2006年第9期29卷 612-616页

作者：揭志军金美玲蔡映云袁正宏胡芸文徐扬任涛杨振华上海第二医科大学附属新华医院呼吸科复旦大学附属中山医院呼吸疾病研究所上海200032 复旦大学上海医学院教育部医学分子病毒学重点实验室

目的研究含非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）能否预防或减轻慢性支气管哮喘（简称哮喘）小鼠气道重塑的发生。方法 40只雌性清洁级C57BL／6小鼠按随机数字表法分为4组，每组10只。（1）慢性哮喘组（A组）... 详细信息

目的研究含非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）能否预防或减轻慢性支气管哮喘（简称哮喘）小鼠气道重塑的发生。方法 40只雌性清洁级C57BL／6小鼠按随机数字表法分为4组，每组10只。（1）慢性哮喘组（A组）：分别于第1、14天小鼠腹腔注射1ml致敏液[卵蛋白（OVA，10μg）＋氢氧化铝凝胶（100μg）]；从第21天开始雾化吸入2．5％OVA溶液，每次30min，每周3次，连续8周。（2）CpG—ODN干预组（B组）：在OVA致敏的同时给予浓度为60μg／ml的CpG—ODN腹腔注射1ml共2次，以后每2周腹腔注射1次共4次。（3）GpC—ODN对照组（C组）：将CpG替换为鸟嘌呤-磷酸-胞嘧啶（GpC，剂量及用法同CpG-ODN）作为对照。（4）生理盐水（NS）对照组（D组）：给予NS进行致敏（每次1ml腹腔注射）和激发（用NS雾化吸入）。在末次激发24h后所有小鼠取血测嗜酸粒细胞（EOS）数和血清IgE；收集支气管肺泡灌洗液（BALF）做细胞分类计数，用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测上清液中自细胞介素13（IL-13）和转化生长因子β1（TGF—β1）的浓度。取左肺组织行苏木精-伊红（HE）染色和Masson三色染色，用抗α平滑肌肌动蛋白（α—SMA）抗体和抗TGF—β1抗体行免疫组化染色。结果 A组外周血EOS计数为（89±10）×10^4／ml、血清IgE为（279±53）ng／ml，BALF中EOS计数和分类分别为（6．30±1．30）×10^5／ml、0．181±0．030，A组IL-13浓度为（4015±361）pg／ml、TGF—β1浓度为（356±64）pg／ml，以上数值与D组比较差异有统计学意义（t值分别为24．0、15．7、14．7、18．4、12．0和18．9，P均〈0．01）；A组Masson三色染色、α-SMA、TGF-β1阳性染色面积百分比[分别为（29．7±4．2）％、（45±7）％、（34±4）％]与D组比较差异也有统计学意义（t值分别为18．0、15．6和17．9，P均〈0．01）。应用CpG-ODN干预后（B组）的Masson三色染色、α—SMA、TGF—β1阳性染色面积百分比[分别为（13．8±3．2）％、（25±3）％、（18±4）％]与A组比较差异也有统计学意义（t值分别为9．5、8．9、9．8，P均〈0．05）。结论应用CpG-ODN干预慢性哮喘模型，不仅能抑制Th2细胞反应和EOS肺浸润，还能抑制气道重塑的发生和发展，它可能是通过抑制TGF—β1、IL-13等因子而抑制气道重塑的。

关键词：哮喘气道重塑炎症小鼠 CpG-寡脱氧核苷酸

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卡介菌多糖核酸免疫治疗结核病小鼠的实验研究

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复旦学报（医学版） 2005年第5期32卷 513-516,F0002页

作者：任涛蔡映云金美玲李传友袁正宏田苗赵冰复旦大学附属中山医院呼吸病研究所北京市结核病胸部肿瘤研究所北京101149 复旦大学上海医学院医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室上海200032

目的观察卡介菌多糖核酸(BCGPSN)对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫保护作用及其免疫学机制。方法将BALB/c小鼠48只随机分成BCGPSN免疫治疗组和结核菌感染对照组,每组24只。两组小鼠制成结核分枝杆菌感染模型。感染后1周,每天分别腹腔内注射... 详细信息

目的观察卡介菌多糖核酸(BCGPSN)对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫保护作用及其免疫学机制。方法将BALB/c小鼠48只随机分成BCGPSN免疫治疗组和结核菌感染对照组,每组24只。两组小鼠制成结核分枝杆菌感染模型。感染后1周,每天分别腹腔内注射BCGPSN(10mg/kg)或生理盐水(10mL/kg),连续7d。感染后3周和4周每组处死12只小鼠,检测小鼠体重以及肺、脾脏湿重,观察肺脏病理改变,取肺、脾组织进行结核菌培养和菌落计数,用real-timePCR法测定肺、脾组织IFNγmRNA、IL10mRNA和IL4mRNA的表达。结果感染后4周,治疗组小鼠体重和脾脏重量高于对照组,肺脏重量低于对照组,且肺部病变较轻。感染后3周和4周,治疗组小鼠肺、脾组织结核菌落均低于对照组,小鼠肺组织IFNγmRNA表达与对照组无差别,IL10mRNA和IL4mRNA的表达低于对照组。感染后3周,治疗组小鼠脾组织IFNγmRNA表达与对照组相似;感染后4周,脾组织治疗组脾组织IFNγmRNA的表达高于对照组。感染后3周和4周,IL10mRNA和IL4mRNA的表达低于对照组。结论BCGPSN可减轻结核病小鼠体重下降,减少结核病小鼠肺和脾脏结核菌数量,并增强Th1型免疫反应。

关键词：卡介菌多糖核酸分枝杆菌结核细胞因子

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trap基因表达在表皮葡萄球菌生物膜形成及附属基因调节(agr)系统活化中的作用

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复旦学报（医学版） 2006年第5期33卷 580-586页

作者：朱于莉杨晓梅李娜江娟陈洁敏秦智强李敏吕元魏武瞿涤复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室上海200032 复旦大学蛋白质组学研究中心上海200032 复旦大学附属华山医院检验医学中心上海200040 上海生物信息技术研究中心上海200235

目的研究表皮葡萄球菌trap基因表达与生物膜形成的相关性及其对agr系统的活化作用。方法采用微量板半定量法检测表皮葡萄球菌生物膜表型,二维电泳和高灵敏度的基质辅助激光解吸附飞行时间质谱分析比较表皮葡萄球菌标准株蛋白质表达谱,... 详细信息

目的研究表皮葡萄球菌trap基因表达与生物膜形成的相关性及其对agr系统的活化作用。方法采用微量板半定量法检测表皮葡萄球菌生物膜表型,二维电泳和高灵敏度的基质辅助激光解吸附飞行时间质谱分析比较表皮葡萄球菌标准株蛋白质表达谱,实时定量逆转录PCR检测trap基因和RNAⅢ的转录水平,CLUSTAL X对表皮葡萄球菌trap基因与金黄色葡萄球菌序列进行分析,Mega软件构建进化树。结果比较分析形成生物膜的表皮葡萄球菌ATCC 35984株与不形成生物膜的ATCC 12228株生长中期的蛋白质组,发现ATCC 35984株的TRAP蛋白量明显高于ATCC 12228株。转录水平的检测显示ATCC 12228株和生物膜阳性临床SE1457、SE671株的trap基因均低转录,但RNAⅢ的转录水平未降低。SE1457株agr系统突变后,RNAⅢ的转录明显降低,trap基因的转录无变化。RNAⅢ的转录随细菌生长变化而增加,trap基因转录保持不变。trap序列分析显示其在表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌中较为保守,但存在明显的进化距离。结论在本论文所研究的表皮葡萄球菌菌株中,trap基因的转录和翻译与细菌生物膜的形成不存在直接的调控相关性;并提示TRAP蛋白不是表皮葡萄球菌agr系统活化所必需的细菌产物;表皮葡萄球菌trap基因序列与金黄色葡萄球菌之间存在差异,可能与其功能差异相关。

关键词：表皮葡萄球菌 trap基因附属基因调节系统 RNAⅢ 生物膜

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CpG岛岸甲基化调控人T细胞系中lag3表达

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中华微生物学和免疫学杂志 2015年第7期35卷 491-495页

作者：郝书民仇超张林霞张晓燕徐建青复旦大学附属公共卫生临床中心上海201508 复旦大学生物医学研究院复旦大学基础医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室

目的探讨表观遗传因素DNA甲基化对人T细胞系中淋巴细胞活化基因3（1ympho—cyteactivationgene3，lag3）表达的影响。方法检测不同T细胞系中lag3的表达水平，选定lag3表达高低相对的细胞系组成研究系统。分析lag3启动子和转录区的CpG分... 详细信息

目的探讨表观遗传因素DNA甲基化对人T细胞系中淋巴细胞活化基因3（1ympho—cyteactivationgene3，lag3）表达的影响。方法检测不同T细胞系中lag3的表达水平，选定lag3表达高低相对的细胞系组成研究系统。分析lag3启动子和转录区的CpG分布以确定潜在表观调控区（CpG岛和CpG岛岸），分别测定各T细胞系中相关区段的DNA甲基化水平。用5-杂氮胞苷（5-Aza．2＇-deoxycytidine，5-Aza-2’-dc）对细胞系做去甲基化处理，检测z0邸表达水平及DNA甲基化水平的变化。结果lag3表达水平在***1．6和CEM细胞中极低，在JurkatE6-1细胞中相对较高。不同细胞系中，CpG岛均高度甲基化；CpG岛岸在***1．6和CEM细胞中高度甲基化，但在JurkatE6—1细胞中甲基化水平较低。5-Aza-2’-dc处理后，***1．6和CEM细胞中lag3mRNA和蛋白质的表达均显著上调，且伴随CpG岛岸去甲基化；而JurkatE6-1细胞中，未见CpG岛岸甲基化和lag3表达水平的显著变化。5-Aza-2＇-dc处理不能使CpG岛去甲基化。结论CpG岛岸的甲基化与去甲基化是lag3转录的表观调控开关。

关键词： DNA甲基化 CpG岛岸 lag3 人T细胞系

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Ⅱ型成簇恒间隔短回文序列及相关蛋白系统（CRISPR／Cas）研究近况

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中华微生物学和免疫学杂志 2014年第10期34卷 798-802页

作者：王蕾马丽俐孙桂芹李蒙策力木格陈力复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室 200032 浙江中医药大学附属第一医院杭州340006

1987年在大肠杆菌K12的碱性磷酸酶（ iap）基因的3′侧翼区首先发现了一类具有短回文特质的DNA重复序列［1］。2002年，这类结构被正式命名为成簇恒间隔短回文重复序列（CRISPR），CRISPR关联蛋白也同时得以命名［2］。2005年，3个研究... 详细信息

1987年在大肠杆菌K12的碱性磷酸酶（ iap）基因的3′侧翼区首先发现了一类具有短回文特质的DNA重复序列［1］。2002年，这类结构被正式命名为成簇恒间隔短回文重复序列（CRISPR），CRISPR关联蛋白也同时得以命名［2］。2005年，3个研究课题组同时发现间隔序列可能源自于细菌染色体外的其他遗传物质，如噬菌体和接合质粒，并推论CRISPR／Cas系统可以抵制入侵的外源 DNA［3-5］。2007年，来源于侵染噬菌体的新的整合间隔序列得到实验验证；研究同时建立了新获得的间隔序列与细菌抵抗该噬菌体侵袭的直接关联关系，证明了CRISPR／Cas系统是抵抗噬菌体的获得性免疫系统［6］。 Marraffini和Sontheimer［7］证实CRISPR／Cas系统对于接合现象和质粒转化的干扰作用。最近基于CRISPR／Cas作用机制的研究，发现了其在细菌毒力、致病性以及如何逃避宿主免疫系统等方面的相关作用［8］。

关键词： Cas系统回文序列蛋白系统成簇 DNA重复序列大肠杆菌K12 Ⅱ型细菌染色

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一种新乙型肝炎病毒表型耐药分析方法的建立

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中华传染病杂志 2014年第5期32卷 257-262页

作者：李新艳陈良马张妹毛日成黄玉仙张继明上海市公共卫生临床中心肝病科 201508 复旦大学上海医学院教育部、卫生部医学分子病毒学重点实验室复旦大学附属华山医院感染科

目的建立一种新的、简便的HBV表型耐药分析方法,通过置换完整的反转录酶（RT）区研究药物敏感性.方法首先全基因扩增未经核苷（酸）类似物治疗患者的HBV DNA,构建含HBV野毒株全基因组表达质粒PHY536207（B基因型）及PHY97（C基因型）... 详细信息

目的建立一种新的、简便的HBV表型耐药分析方法,通过置换完整的反转录酶（RT）区研究药物敏感性.方法首先全基因扩增未经核苷（酸）类似物治疗患者的HBV DNA,构建含HBV野毒株全基因组表达质粒PHY536207（B基因型）及PHY97（C基因型）,继而在RT区上、下游设计限制酶切位点,改造后的质粒分别命名为mPHY536207及mPHY97.以CHB患者血清中分离到的拉米夫定（LAM）耐药变异株和阿德福韦酯（ADV）耐药变异株为骨架,分别构建LAM耐药株质粒PHY634和ADV耐药株质粒PHY6923,再用耐药株的RT区段取代mPHY536207中的RT区构建重组质粒,命名为RT634（LAM耐药）及RT6923（ADV耐药）.分别用RT区置换前、后的质粒转染Huh7细胞,用ELISA法检测分泌到细胞上清液中的HBsAg水平,用实时PCR和Southern印迹法检测细胞内HBVDNA水平.结果成功构建B型和C型野毒株表达质粒PHY536207和PHY97,经转染Huh7细胞证实有HBV复制能力,6孔细胞培养板中每孔细胞所抽提的HBV DNA均＞1＆#215;107拷贝/mL;在RT区上游设计的Pst Ⅰ酶切位点不影响HBV的表型（HBsAg的表达及HBV DNA的复制）.在PHY634及RT634转染实验中,HBV DNA水平却并未随LAM浓度的升高而明显下降,50％抑制浓度（IC50）＞100 μmol/L,mPHY536207仅为0.18 μmol/L;PHY6923及RT6923转染实验中,HBV DNA对外加的ADV不敏感,IC50＞100 μmol/L,明显高于mPHY536207（1.2 μmol/L）.结论本研究建立了一种新的HBV表型耐药分析方法,可通过RT区置换来研究RT区变异对药物敏感性的影响.

关键词：肝炎病毒,乙型 RNA指导的DNA聚合酶抗药性表型

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表皮葡萄球菌双组分信号转导系统saeRS对相关蛋白调控的研究

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西安交通大学学报（医学版） 2012年第6期33卷 680-684页

作者：娄强王艳歌瞿涤河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室河南开封475004 河南大学医学院细胞生物学教研室河南开封475004 复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室上海200032

目的利用双向电泳技术对表皮葡萄球菌菌体蛋白进行蛋白质组学分析,寻找双组分信号转导系统saeRS的调控网络。方法对表皮葡萄球菌1457双组分信号转导系统saeRS删除株与野生株菌体蛋白进行双向电泳差异比较;电泳图谱采用Image Master 2DPl... 详细信息

目的利用双向电泳技术对表皮葡萄球菌菌体蛋白进行蛋白质组学分析,寻找双组分信号转导系统saeRS的调控网络。方法对表皮葡萄球菌1457双组分信号转导系统saeRS删除株与野生株菌体蛋白进行双向电泳差异比较;电泳图谱采用Image Master 2DPlatinum软件分析;免疫印迹法验证saeRS调控的差异蛋白。结果在表皮葡萄球菌1457双组分信号转导系统saeRS删除株与野生株蛋白质图谱中共发现23个差异表达的蛋白点(10个下调,13个上调)。结论蛋白质双向电泳技术可以成功应用于分析表皮葡萄球菌双组分信号转导系统saeRS的调控网络;此图谱为进一步研究saeRS在表皮葡萄球菌中的调控机制奠定了基础。

关键词：表皮葡萄球菌双组分信号转导系统 saeRS 蛋白质组双向电泳

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活细胞成像技术实时追踪荧光蛋白标记的分枝杆菌的胞内增殖

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复旦学报（医学版） 2014年第3期41卷 384-388页

作者：乔可王晴岚李紫煜牛辰复旦大学基础医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室上海200032 北京东胜创新生物科技有限公司分子影像部北京100085

目的利用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记和活细胞显微成像的方法,实时追踪分枝杆菌在巨噬细胞内的增殖过程。方法用经GFP标记的野生型海分枝杆菌（Mycobacterium marinum,Mm）分别侵染未激活和γ-干扰素激活的巨... 详细信息

目的利用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记和活细胞显微成像的方法,实时追踪分枝杆菌在巨噬细胞内的增殖过程。方法用经GFP标记的野生型海分枝杆菌（Mycobacterium marinum,Mm）分别侵染未激活和γ-干扰素激活的巨噬细胞,使用活细胞显微成像系统连续记录胞内分枝杆菌的增殖动态,同时优化不同细胞接种浓度和感染复数（multiplicity of infection,MOI）对胞内菌增殖动态的追踪效果。结果使用GFP标记和活细胞成像的方法可以实时追踪胞内分枝杆菌的增殖过程和形态学变化。γ干扰素对Mm在巨噬细胞中的增殖有抑制作用。当接种巨噬细胞浓度为1×105/孔,MOI为1时,可直观清晰地分析实时追踪图像中胞内菌的增殖过程。结论通过活细胞成像技术分析荧光蛋白标记的分枝杆菌,可实时追踪巨噬细胞内分枝杆菌增殖过程和形态学变化,是一种体外分析胞内分枝杆菌增殖的理想方法,可应用于其他相关病原菌和宿主相互作用及影响因素的研究。

关键词：海分枝杆菌(Mm) 巨噬细胞活细胞成像细菌增殖感染复数(MOI)

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N-糖蛋白去糖基化酶(PNGase)的研究进展

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生物化学与生物物理进展 2022年第9期49卷 1630-1637页

作者：陈妍雯袁舒颖刘瑞杰张绍兴邹琳芦鑫荣孔维溧陈力孙桂芹浙江中医药大学医学技术与信息工程学院杭州310053 复旦大学基础医学院病原生物学系医学分子病毒学教育部/卫生健康委员会重点实验室上海200032

N-糖蛋白去糖基化酶(PNGase)是一种广泛存在于真菌、植物、哺乳动物中的去糖基化酶,可以水解N-糖蛋白或N-糖肽上天冬酰胺与寡糖链连接的化学键,并释放出完整的N-寡糖。PNGase在生物体内参与蛋白质降解、器官发育、个体生长等过程。人PNG... 详细信息

N-糖蛋白去糖基化酶(PNGase)是一种广泛存在于真菌、植物、哺乳动物中的去糖基化酶,可以水解N-糖蛋白或N-糖肽上天冬酰胺与寡糖链连接的化学键,并释放出完整的N-寡糖。PNGase在生物体内参与蛋白质降解、器官发育、个体生长等过程。人PNGase基因功能缺陷会导致先天性去糖基化障碍,小鼠PNGase缺陷会导致胚胎致死性,线虫PNGase缺陷使其寿命下降。本文对PNGase在不同物种的分布、蛋白质结构、酶学功能及生物学功能进行阐述,为PNGase的生理病理功能及致病机制的基础研究提供思路,为PNGase作为糖生物学工具酶或药物开发的创新应用研究奠定基础。

关键词： N-糖蛋白去糖基化酶分布蛋白质结构酶学功能生物学功能

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