肥胖已经成为全球性的公共卫生问题,严重影响人类的身体健康和生活品质。本文运用CRISPR/Cas9技术,构建了肥胖相关基因——瘦素受体(leptin receptor,lepr)和黑素皮质素受体4(melanocortin-4 receptor,mc4r)的斑马鱼突变体,并对其进行形态和功能分析。结果显示,lepr^(-/-)和mc4r^(-/-)斑马鱼在胚胎和幼鱼期没有明显异常,但在成年期,lepr^(-/-)和mc4r^(-/-)斑马鱼相比对照进食增多、体重增加、体脂含量升高,呈现肥胖表型。血糖测定结果显示,饱食喂养条件可以诱导lepr^(-/-)和mc4r^(-/-)成年斑马鱼出现糖耐量受损的现象。进一步地,运用real time RT-PCR对76个能量代谢相关基因在lepr^(-/-)和mc4r^(-/-)斑马鱼肝脏中转录表达水平进行检测,并与Lep^(ob/ob)小鼠肝脏c DNA microarray的数据比较,发现胰岛素/胰岛素样生长因子信号转导通路(insulin/IGF signaling pathway,ISS)相关的基因在lepr^(-/-)斑马鱼和Lep^(ob/ob)小鼠肝脏中表达变化具有较高的正相关性,提示肥胖调控网络在进化中维持了一定的功能保守性。
目的表达和纯化人脂联素(adiponectin,APN)球状结构域并观察其生物学活性。方法用PCR方法复制人脂联素球状结构域(globular domain of adiponectin,gAPN)的cDNA,并克隆于pET28a(+)原核表达载体中。将重组表达质粒pET28a(+)-gAPN转化大...
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目的表达和纯化人脂联素(adiponectin,APN)球状结构域并观察其生物学活性。方法用PCR方法复制人脂联素球状结构域(globular domain of adiponectin,gAPN)的cDNA,并克隆于pET28a(+)原核表达载体中。将重组表达质粒pET28a(+)-gAPN转化大肠埃希菌BL21(DE3),37℃培养至A600达到0.6时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白的表达。细菌经超声破菌,得到粗提的包涵体洗涤变性后经镍柱亲和层析柱一步纯化,获得纯化的gAPN重组蛋白,复性后冻干保存。然后,用链佐星(streptozocin,STZ)诱导的小鼠高血糖模型检测其生物活性。结果IPTG诱导后有Mr约为17 000大小的目的蛋白表达,免疫印迹结果进一步表明,其具有人gAPN的抗原性。表达蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体蛋白的30%以上,表达产物经变性、纯化、复性,可获得纯度90%以上的目的蛋白。该重组蛋白能够降低STZ诱导的小鼠高血糖模型的血糖水平。结论在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功表达了人gAPN蛋白,经变性、纯化、复性后得到具有生物学活性的蛋白。
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