死亡时间(postmortem interval,PMI)是指发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔。PMI的准确推断具有重要的法医学实践价值,一直是法医学病理学研究的重点和难点。利用传统的方法进行死亡时间的推断一直受到各种因素的制约,如环境温度,死亡原因等,导致推断的准确性和精确性较低。随着分子生物学技术在法医学领域的广泛应用,利用生物体内RNA的时间依赖性降解规律推断死亡时间正逐渐成为目前研究的热点。实时定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)作为RNA表达量的精确定量技术,具有准确高效的优点,被越来越多的应用于PMI的推断,但其结果必须依赖于稳定内参指标的标准化,目前构建的推断PMI模型相对单一,通常只考虑单个因素的影响,而忽略多组织、多温度和多死因的探讨,实际应用受限。本实验利用实时定量PCR技术,检测已知明确死亡时间的人体组织和动物模型组织中(心肌、肝脏和皮肤)多个RNA指标的表达量,以期发现受各因素影响较小的RNA指标作为标准化的内参指标。在此基础上,针对大鼠组织内特定RNA指标进行死后不同时间的规律性研究,综合多个分子指标构建多组织、多温度组的数学模型用以推断死亡时间；将明确死亡时间的大鼠样本和人体资料代入方程进行验证,探讨环境温度及死亡原因等因素对死亡时间推断的影响程度,以期为人体死亡时间的精确推断提供新的方法与理论基础。此外,本研究也通过构建不同死因的大鼠模型,检测心肌多种RNA指标在死后不同时间点的表达变化情况,以期为不同死因下的死亡时间推断提供一种新的思路。研究目的1.通过实时定量PCR技术对人体组织及大鼠组织中各RNA指标的转录水平进行检测,旨在寻找出稳定通用的内参标志物用以精确的推断死亡时间。2.设置四个连续的温度组,明确断颈死大鼠三种组织中各RNA死后降解规律与死亡时间的相互关系,利用标准化的qRT-PCR数据构建多参数数学模型推测死亡时间。利用已知死亡时间的大鼠样本和人体样本进行数学模型的验证,统计推断死亡时间和真实死亡时间之间的误差率,明确环境温度及死亡原因等因素对死亡时间推断的影响。3.构建断颈死、窒息死和失血性休克三种大鼠死亡模型,明确不同死亡原因下大鼠心肌内多种RNA表达量随随死亡时间的降解规律,以期为不同死因下死亡时间的推断提供参考。方法和结果第一部分1.委托上海市公安局刑事科学技术研究所收集79例人体案例样本组织,每例尸体都准确的记录死亡时间、温度、死因等。每例尸体均取心肌、肝脏和皮肤组织分装于RNAlater保护液,置于-80℃冻存、备用。2.断颈处死288只SD大鼠用以构建模型,尸体立即放置于恒定环境温度下(5±1℃、15±1℃、25±1℃和35±1℃),于死后12个时间点(Oh、1h、3h、6h、12h、 24h、36h、48、72h、96h、120h和144h)分别取出心肌组织、肝脏和皮肤组织；断颈处死6只SD大鼠用以验证模型,放置于恒定环境温度下(10±1℃和20±1℃),于后3个时间点(15h、45h and 95h)取出三种组织；所有组织分装于RNAlater保护液,置于-80℃冻存、备用。选取12个常用的RNA分子指标,并设计引物,分别是ACTB、GAPDH、18S、RPS29、5S、U6、let-7a、miR-1、miR-133a、miR-206、miR-122和miR-203。3.用TRIzol法抽提人体和大鼠组织的总RNA、总RNA浓度和纯度检测和cDNA合成,并应用qRT-PCR检测RNA指标的循环阈值(cycle threshold,Ct)。4.通过geNorm软件对12个候选分子标志物进行统计处理,选取人体组织与动物组织相统一的内参指标。结果显示：5S、U6、miR-133a和RPS29适合作为心肌组织的内参,5S、U6、RPS29和miR-122适合作为肝脏组织的内参,5S、U6、RPS29和miR-203适合作为皮肤组织的内参。第二部分5.对ACTB和GAPDH的Ct值进行内参标准化处理,建立循环阈值差值(deltaCt,△Ct)与PMI的回归方程(一次、二次和三次方程),择优选择构建数学模型。6.将已知PMI的大鼠样本和人体样本△Ct值带入方程进行验证,统计推测PMI的误差率,明确环境温度、死亡原因等因素对精确PMI推断的影响。验证结果表明大鼠样本的总误差率为14.4±2.2%,人体样本的总误差率为34±19%,证实运用该数学模型推断PMI相对准确有效。7.研究发现环境温度升高可以明显的增加RNA的降解速率,详细的环境温度记录可以有效的提高推断PMI的精度。8.在三种组织中,肝脏组织拥有最低的误差率,尤其适合早期PMI的推断；而心肌组织更适合用于晚期PMI的推断；虽然皮肤组织具有最高的误差率,但在某些特殊案件
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