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科学通报 2003年第18期48卷 1949-1953页

作者：陈晓光朱焕章李峰宫菊丽薛京伦复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体 FUXW; 用磷酸钙法,... 详细信息

为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体 FUXW; 用磷酸钙法, 将慢病毒载体与包装质粒CMV△R8.2和包膜质粒VSV-G共转染产毒细胞293 T, 以制备重组慢病毒.重组FUXW病毒分别感染293 T, BHK和L-02细胞, 经检测皆有hFⅨ蛋白表达.重组FAXW病毒感染细胞48 h后, 仅在L-02细胞检测到hFⅨ高表达(630 ng/106细胞), 而在其他感染细胞中hFⅨ表达较低.将重组FAXW病毒经尾静脉途径注射入血友病B小鼠体内, 小鼠血浆中可检测到接近治疗水平的hFⅨ抗原(45 ng/mL), 且持续时间超过60 d.上述结果表明, 慢病毒载体介导的基因转移为血友病B基因治疗提供了极有潜力的方法.

关键词：慢病毒介导人凝血因子Ⅸ cDNA 基因治疗血友病

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绿色器官衰老进程中营养物质的动员与再利用研究进展

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植物生理学报 2014年第9期50卷 1322-1328页

作者：李中朋蒯本科复旦大学生命科学学院植物科学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

绿色器官的衰老是植株生长发育的一个内在组成部分,其重要的生物学意义在于营养物质的动员与再利用。作为最重要的营养"源"器官,衰老叶片中发生大规模的降解代谢活动,由此产生的大量小分子物质,包括糖类,氨基酸,核苷酸和可再... 详细信息

绿色器官的衰老是植株生长发育的一个内在组成部分,其重要的生物学意义在于营养物质的动员与再利用。作为最重要的营养"源"器官,衰老叶片中发生大规模的降解代谢活动,由此产生的大量小分子物质,包括糖类,氨基酸,核苷酸和可再生利用的矿质元素等会通过筛管转运至新生的组织器官,即"库"器官,特别是种子中,为其快速生长发育提供充足的营养供应。本文主要介绍了绿色器官衰老过程中氮素的营养动员与再利用研究进展,包括叶片中蛋白的降解和氨基酸的代谢转化,以及筛管装载和卸载。最后,对未来的研究方向进行了展望,提出了作物叶片光合总量和营养物质利用效率双双趋于最大化的理想叶片衰老模式。

关键词：绿色器官衰老营养物质动员与再利用氮素动员与再利用理想叶片衰老模式

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粪肠球菌中具有启动功能的DNA片段的捕获及鉴定

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复旦学报（自然科学版） 2006年第3期45卷 288-292页

作者：黄路标张伯生任大明复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

PCR扩增来自质粒pUC119的β-内酰胺酶基因(bla)作报告基因,克隆进质粒pNZ8037上的能被Nisin诱导的启动子PnisA下游,构建了粪肠球菌启动功能片段探测载体pNZ-bla.利用该探测载体从粪肠球菌染色体总DNA中克隆到了能在粪肠球菌中表达的一... 详细信息

PCR扩增来自质粒pUC119的β-内酰胺酶基因(bla)作报告基因,克隆进质粒pNZ8037上的能被Nisin诱导的启动子PnisA下游,构建了粪肠球菌启动功能片段探测载体pNZ-bla.利用该探测载体从粪肠球菌染色体总DNA中克隆到了能在粪肠球菌中表达的一系列具有启动功能的DNA片段,将包含克隆片段的pNZ-P-bla6质粒电击转化粪肠球菌,培养转化子并检测其抗氨苄强度,结果表明其抗氨苄强度大于Nisin诱导的含pNZ-bla质粒的粪肠球菌.表明克隆的功能片段启动能力强于PnisA.在pNZ-P-bla6的启动功能片段下游Sau3AⅠ和EcoRⅠ之间接上绿色荧光蛋白基因作为标记,构建表达绿色荧光蛋白的质粒载体pNZ-P-gfp并导入粪肠球菌中,共聚焦显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白的表达.

关键词：乳酸菌粪肠球菌启动子克隆载体 GFP

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利用精原干细胞建立人凝血因子Ⅸ转基因小鼠

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科学通报 2003年第17期48卷 1848-1850页

作者：王宁陈晓光姚纪花沈琦薛京伦复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

用玻璃针将Effectene^(TM)包裹的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)表达载体注入小鼠的曲精细管. 通过PCR和Southern印迹法对子代41只小鼠进行鉴定,有2只小鼠的基因组中整合有hFⅨ基因表达框架,整合率为4％(2/41).通过ELISA方法在其中1只小鼠的血浆中... 详细信息

用玻璃针将Effectene^(TM)包裹的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)表达载体注入小鼠的曲精细管. 通过PCR和Southern印迹法对子代41只小鼠进行鉴定,有2只小鼠的基因组中整合有hFⅨ基因表达框架,整合率为4％(2/41).通过ELISA方法在其中1只小鼠的血浆中检测到hFⅨ的表达,表达量为4.6 ng/mL.实验证明,精原干细胞法是建立转基因动物的有效途径,为乳腺反应器的研究提供了另一个技术手段. 同时也为通过生殖细胞途径治疗血友病B提供了新的选择.

关键词：精原干细胞人凝血因子Ⅸ 转基因基因组基因表达乳腺反应器

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人血管生成素样蛋白4在毕赤氏酵母中的表达及其生物活性的初步研究

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复旦学报（自然科学版） 2004年第2期43卷 147-151页

作者：吕红丁宁张腾李育阳复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

将编码人的血管生成素样蛋白 4 (ANGPTL4 )的cDNA克隆至分泌表达载体pPIC9k上 ,在PichiaPas toris酵母宿主菌SMD116 8中获得分泌表达 ;用MTT方法检测的细胞生长抑制实验结果表明。

关键词：血管生成素样蛋白4 酵母分泌表达内皮细胞增殖分析

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绿色器官衰老进程中叶绿素降解代谢及其调控的研究进展

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植物生理学报 2014年第9期50卷 1315-1321页

作者：陈俊毅朱晓宇蒯本科复旦大学生命科学学院植物科学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

褪绿(degreening)现象是绿色器官衰老的显著标志,其中涉及的叶绿素急速降解是植物衰老的特征性生理生化过程。近十余年来,叶绿素降解的主要生化途径(PAO途径)已基本被阐明。游离的叶绿素及其代谢中间产物具有潜在的光毒性,因此精准调控... 详细信息

褪绿(degreening)现象是绿色器官衰老的显著标志,其中涉及的叶绿素急速降解是植物衰老的特征性生理生化过程。近十余年来,叶绿素降解的主要生化途径(PAO途径)已基本被阐明。游离的叶绿素及其代谢中间产物具有潜在的光毒性,因此精准调控的叶绿素降解被认为是一个高效有序的解毒过程。目前关于叶绿素降解的全局性调控机制依然知之甚少;多个物种中叶绿素降解关键调控因子SGRs/NYEs的鉴别及其相关作用机理的初步揭示是该领域近年来的最显要进展。上述研究基础预示着近期在叶绿素降解调控的多个方向上可能会取得实质性乃至突破性进展。

关键词：衰老叶绿素降解与调控 PAO途径 SGRs/NYEs

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大肠杆菌aroL基因敲除及其对莽草酸合成的影响

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复旦学报（自然科学版） 2007年第3期46卷 366-370页

作者：付小花高益范郝思捷张伯生任大明复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

以*** DH5α基因组为模板克隆莽草酸激酶Ⅱ基因(aroL),构建质粒pMD-aroL,经HpaⅠ、BsaBⅠ酶切后插入卡那霉素抗性基因(kan)得pMD-aroL::kan,利用pKD46的λ重组系统,用该质粒上的kan及两端的aroL同源序列替换*** Top10F′基因组上的aroL... 详细信息

以*** DH5α基因组为模板克隆莽草酸激酶Ⅱ基因(aroL),构建质粒pMD-aroL,经HpaⅠ、BsaBⅠ酶切后插入卡那霉素抗性基因(kan)得pMD-aroL::kan,利用pKD46的λ重组系统,用该质粒上的kan及两端的aroL同源序列替换*** Top10F′基因组上的aroL基因,再运用质粒pCP20编码的FLP重组酶消除kan基因.Southern blot证实基因敲除是成功的,测序结果表明kan已经从基因组上消除,摇瓶发酵显示构建的基因工程菌的莽草酸产量是原始菌株的1.57倍.

关键词： aroL 基因敲除 Red重组系统

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人纤溶蛋白酶原K5在毕赤酵母中的表达及其生物活性鉴定

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生物工程学报 2004年第6期20卷 879-883页

作者：沈利宋大新高卜渝吕红李育阳复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

化学合成人纤溶蛋白酶原K5 (pK5 )的编码基因并克隆到毕赤氏酵母表达系统的分泌型载体pPIC9K上 ,将重组质粒经BglⅡ单酶切后电转化PichiapastorisGS115菌株 ,筛选出对G4 18有高抗性和在MM培养基上生长缓慢的转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱... 详细信息

化学合成人纤溶蛋白酶原K5 (pK5 )的编码基因并克隆到毕赤氏酵母表达系统的分泌型载体pPIC9K上 ,将重组质粒经BglⅡ单酶切后电转化PichiapastorisGS115菌株 ,筛选出对G4 18有高抗性和在MM培养基上生长缓慢的转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱导后 ,用 15 %SDS PAGE检测发酵上清液 ,表明有重组蛋白pK5的高表达。经CM Sepherose离子交换柱和Superdex 75分子筛层析两步分离纯化 ,获得了纯度达到 98%的rpK5。用MTT方法检测的结果表明。

关键词：人纤溶蛋白酶原K5 酵母分泌表达内皮细胞增殖分析

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抗A5型口蹄疫病毒重组多肽疫苗的研究

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复旦学报（自然科学版） 2005年第6期44卷 1037-1041页

作者：刘明秋张骏陈维灶严维耀郑兆鑫复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

根据A型口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因序列及国际上公认的抗病毒中和表位,并结合对口蹄疫病毒的研究成果,设计了A型FMDV的重组多肽疫苗.分别选择VP1上21～40位和137～160位氨基酸对应的基因序列为表位基因,组成137～160-21～40-137～160的... 详细信息

根据A型口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因序列及国际上公认的抗病毒中和表位,并结合对口蹄疫病毒的研究成果,设计了A型FMDV的重组多肽疫苗.分别选择VP1上21～40位和137～160位氨基酸对应的基因序列为表位基因,组成137～160-21～40-137～160的串连结构,并以大肠杆菌β-半乳糖苷酶为大分子载体,构建重组质粒pLM99,在大肠杆菌中表达得到高含量的融和蛋白.体外免疫原性检测表明,所表达的融和蛋白与标准A型阳性血清有特异性抗原/抗体反应,即说明该融和蛋白具有免疫反应性.免疫豚鼠的实验结果表明,融合蛋白能在豚鼠体内诱导中和抗体,并使70%的豚鼠能抵抗病毒的攻击.

关键词： A型口蹄疫病毒抗原表位多肽疫苗

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乳酸菌表达质粒的构建

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复旦学报（自然科学版） 2004年第6期43卷 1056-1060页

作者：倪伟明黄路标王荫榆刘国元张伯生任大明复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

粪肠球菌是乳酸菌的一个属.采用生物信息学方法,预测了粪肠球菌AS1.2984基因组中乳酸脱氢酶和三磷酸甘油醛脱氢酶的组成型启动子序列.设计引物通过PCR扩增得到这2段启动子序列,并克隆到乳酸菌大肠杆菌穿梭质粒pNZ8037上,在启动子下游... 详细信息

粪肠球菌是乳酸菌的一个属.采用生物信息学方法,预测了粪肠球菌AS1.2984基因组中乳酸脱氢酶和三磷酸甘油醛脱氢酶的组成型启动子序列.设计引物通过PCR扩增得到这2段启动子序列,并克隆到乳酸菌大肠杆菌穿梭质粒pNZ8037上,在启动子下游接上绿色荧光蛋白基因作为标记,构建乳酸菌的组成型蛋白表达质粒.通过电转化将上述改造过的pNZ8037质粒导入粪肠球菌中,在共聚焦显微镜中可以观察到绿色荧光蛋白的表达.在乳酸菌MRS培养基中加入乳酸、盐酸、氢氧化钠等试剂,发现可以调节绿色荧光蛋白的表达量.

关键词：粪肠球菌表达质粒启动子绿色荧光蛋白蛋白表达乳酸脱氢酶观察电转化 MRS培养基乳酸菌

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