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复旦学报（自然科学版） 2020年第6期59卷 685-694页

作者：谢晋杨德强周峻岗李翊峰吕红复旦大学遗传工程国家重点实验室上海200438 无锡药明生物技术有限公司江苏无锡214092 复旦大学生命科学学院上海工业菌株工程技术研究中心上海200438 上海药明生物技术有限公司上海200131

猪圆环病毒(PCV)是一种引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、呼吸道综合征及繁殖障碍的病毒,已经成为危害养猪业最主要的病原之一,而接种猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗是控制猪圆环病毒相关疾病最有效的措施.利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces m... 详细信息

猪圆环病毒(PCV)是一种引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、呼吸道综合征及繁殖障碍的病毒,已经成为危害养猪业最主要的病原之一,而接种猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗是控制猪圆环病毒相关疾病最有效的措施.利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus,KM)表达猪圆环病毒PCV2 Cap的产量可达2g/L,高于其他表达系统的产量,并且重组表达的Cap蛋白在胞内能高效自组装成病毒样颗粒(Virus-Like Particles,VLPs).酵母细胞破碎之后样品中含有大量的微小的细胞碎片,高速离心澄清难以分离,影响了VLPs的得率、纯度以及澄清度.本研究考察了超声波破碎、玻璃珠研磨破碎以及高压均质破碎等不同破碎方法,发现1300bar高压均质法对重组表达PCV Cap蛋白的马克斯克鲁维酵母破碎效果最佳.在此基础上,检测添加有机溶剂、表面活性剂和化学絮凝剂的处理效果,发现添加1%(质量分数)Triton X-100对酵母破碎菌液具有65%以上的浊度降低率,处理后样品可直接用于离子交换层析,得率大于92%,HPLC纯度大于85%.

关键词：马克斯克鲁维酵母猪圆环病毒病毒样颗粒浊度纯化

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O型口蹄疫病毒VP4蛋白一个保守性表位的精细鉴定

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复旦学报（自然科学版） 2014年第6期53卷 710-715,723,F0002页

作者：栾喜梅左小彤黄梦菡郑兆鑫黄强徐万祥刘明秋复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室、上海工业菌株工程技术研究中心上海200433 上海市计划生育科学研究所国家人口和计划生育委员会计划生育药具重点实验室生殖医药研究室上海200032

口蹄疫病毒(FMDV)的结构蛋白VP4在7个血清型之间是非常保守的,对其抗原表位最小基序的测定有助于开发广谱性多肽疫苗.本研究采用生物合成肽法,利用豚鼠抗FMDV O型标准血清,对最新流行的FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010的VP4蛋白进行了线性表... 详细信息

口蹄疫病毒(FMDV)的结构蛋白VP4在7个血清型之间是非常保守的,对其抗原表位最小基序的测定有助于开发广谱性多肽疫苗.本研究采用生物合成肽法,利用豚鼠抗FMDV O型标准血清,对最新流行的FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010的VP4蛋白进行了线性表位扫描作图研究.结果表明:在覆盖VP4蛋白全长序列的10个18聚肽中,发现1个能与豚鼠抗FMDV O型标准血清发生免疫印迹反应的抗原性肽VP4-3;B细胞表位鉴定确定了抗体识别VP4-3的最小基序是INNYYM;该表位位于VP4蛋白的三维结构表面;对7个FMDV血清型的122个毒株同源蛋白质进行序列比对,发现这一表位在7个FMDV血清型的120个毒株中是100%保守.

关键词：口蹄疫病毒 VP4蛋白表位扫描作图生物合成肽

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烟曲霉Asp f3和Asp f4的表达纯化与多克隆抗体的制备

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复旦学报（自然科学版） 2015年第5期54卷 601-608页

作者：高岩霍克克季朝能唐海平徐万祥谢毅顾少华复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室上海200438 上海市工业菌株工程技术研究中心上海200438 上海市计划生育科学研究所国家人口和计划生育委员会重点实验室上海200032

侵袭性曲霉病以烟曲霉在肺部定植、侵袭为主,具有较高的致死率.治疗侵袭性曲霉病的关键是早期确诊.目前临床上用于诊断侵袭性曲霉病的血清学方法是检测血清中半乳甘露聚糖循环抗原的GM试验,在敏感性和特异性方面存在局限性.为了用抗重... 详细信息

侵袭性曲霉病以烟曲霉在肺部定植、侵袭为主,具有较高的致死率.治疗侵袭性曲霉病的关键是早期确诊.目前临床上用于诊断侵袭性曲霉病的血清学方法是检测血清中半乳甘露聚糖循环抗原的GM试验,在敏感性和特异性方面存在局限性.为了用抗重组蛋白多克隆抗体鉴定和分析烟曲霉Asp f3和Asp f4特异性和曲霉广谱性表位,构建检测可疑血清样本中相应抗体的表位嵌合肽,以诊断侵袭性曲霉病.本研究表达纯化了烟曲霉Asp f3和Asp f4重组蛋白,制备了IgG抗体滴度均在1.28×106以上的高滴度的兔抗重组蛋白多克隆抗体.

关键词：烟曲霉 Asp f3 Asp f4 表达纯化抗体制备

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红树林土壤微生物模块化聚酮合酶基因(簇)及其多样性研究

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复旦学报（自然科学版） 2015年第2期54卷 137-147页

作者：张翔周峻岗董俊德吕红复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室上海市工业菌株工程技术研究中心上海200433 中国科学院南海海洋研究所中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室广州510301

聚酮类化合物(Polyketide)是一类重要的具有药用价值的生物活性分子.通过宏基因组学技术获得了红树林土壤微生物中模块化聚酮合酶(Polyketide Synthase,PKS)基因(簇),并对其多样性进行了研究.首先构建了该红树林土壤微生物的16SrDNA文库... 详细信息

聚酮类化合物(Polyketide)是一类重要的具有药用价值的生物活性分子.通过宏基因组学技术获得了红树林土壤微生物中模块化聚酮合酶(Polyketide Synthase,PKS)基因(簇),并对其多样性进行了研究.首先构建了该红树林土壤微生物的16SrDNA文库,初步分析了红树林土壤样本的细菌群落组成,发现许多菌群曾经被报道存在PKS基因簇,约占整个细菌群落的75%.利用相关菌群的PKS酮基合成酶结构域(Ketosynthase,KS)的保守区域序列信息设计简并引物,并构建了KS DNA序列文库.经测序获得131条新型KS序列,该结果表明红树林土壤微生物中蕴含了许多新型的聚酮类化合物合成酶.为了进一步获得聚酮合酶基因(簇),我们通过土壤微生物宏基因组Cosmid文库的构建与筛选,得到了13个属于trans-AT PKS,cis-AT PKS,NRPS/PKS Hybrid等类型的聚酮合酶的基因(簇),并通过构建KS序列的系统进化树分析了样本中聚酮合酶的多样性组成.

关键词：宏基因组红树林土壤微生物聚酮合酶(PKS) 聚酮合酶基因簇多样性分析

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HPV58型E2蛋白表达纯化与多克隆抗体制备

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生殖与避孕 2015年第10期35卷 674-679页

作者：姜文婷程一航唐海平谢毅连文博詹建民徐万祥顾少华复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室上海市工业菌株工程技术研究中心上海200438 上海市计划生育科学研究所国家人口和计划生育委员会重点实验室上海200032

目的:表达纯化重组人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型E2蛋白,制备多克隆抗体。方法:构建重组质粒p ET-28b-E2,转化至BL21(DE3)p Lys S中诱导表达,包涵体洗涤后经镍柱亲和层析分离得到纯化目的蛋白。用纯化的重组E2蛋白免疫新... 详细信息

目的:表达纯化重组人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型E2蛋白,制备多克隆抗体。方法:构建重组质粒p ET-28b-E2,转化至BL21(DE3)p Lys S中诱导表达,包涵体洗涤后经镍柱亲和层析分离得到纯化目的蛋白。用纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗HPV58型E2蛋白多克隆抗体,ELISA分析多克隆抗体的效价,免疫印迹检测抗体的特异性。结果:表达纯化了重组HPV58型E2蛋白,制备了高滴度和高特异性的多克隆抗体。结论:制备的多克隆抗体可用于对HPV58型E2蛋白进行精细B细胞线性表位鉴定。

关键词： HPV58型E2蛋白蛋白表达包涵体纯化抗体制备

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结核分枝杆菌核糖体蛋白丙氨酸乙酰转移酶过表达菌株的构建及分析

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微生物与感染 2021年第1期16卷 37-44页

作者：陈润白嘉诚狄玉昌钱嘉宁毕静张雪莲复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室上海200433 复旦大学上海工业菌株工程技术研究中心上海200433

rim I基因编码的核糖体蛋白丙氨酸乙酰转移酶(ribosomal-protein-alanine acetyltransferase,RimI)为结核分枝杆菌GCN5相关N-乙酰转移酶家族成员,其在结核分枝杆菌中的生物学功能尚不十分清楚。为探索RimI的生物学特性及其对结核分枝杆... 详细信息

rim I基因编码的核糖体蛋白丙氨酸乙酰转移酶(ribosomal-protein-alanine acetyltransferase,RimI)为结核分枝杆菌GCN5相关N-乙酰转移酶家族成员,其在结核分枝杆菌中的生物学功能尚不十分清楚。为探索RimI的生物学特性及其对结核分枝杆菌致病性的影响,本研究以耻垢分枝杆菌为模式菌,构建过表达结核分枝杆菌rimI基因的重组菌株Msm∷pMV261-rimI。分别培养Msm∷pMV261-rimI菌株和对照Msm∷pMV261菌株,分析两者生长速率、菌落形态和生物膜形成的差异,以及耐受低氧、低pH值、H 2O 2、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)和0.05%~1%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)等逆环境的能力;并将两种菌株分别接种于鼠巨噬细胞RAW264.7,观察两者在巨噬细胞内的存活能力。结果表明,相较于对照菌株,过表达rimI的菌株在生长前中期速率降低,生物膜早期成膜变缓,但不影响生物膜的后期成熟。同时,过表达rimI的菌株抵抗低氧、低pH值、H 2O 2等逆环境的能力增强,在巨噬细胞内的存活能力增强。结果提示,rimI基因对分枝杆菌的生物膜形成、抗逆性及细胞内生存具有重要作用,可能与结核分枝杆菌的毒力密切相关。

关键词：结核分枝杆菌 rimI基因乙酰转移酶抗逆性毒力

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深海耐盐杆菌来源酯酶PE8的表达纯化、结晶和晶体X-ray衍射研究（英文）

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复旦学报（自然科学版） 2016年第4期55卷 534-537页

作者：纪锐匡思运霍颖异黄静兰星洋许学伟李继喜复旦大学生命科学学院上海市工业菌株工程技术研究中心上海200438 复旦大学遗传工程国家重点实验室上海200438 国家海洋局第二海洋研究所海洋生态系统和生物地球化学重点实验室浙江杭州310012

从深海耐盐杆菌Pelagibacterium halotolerans B2T中分离鉴定的酯酶PE8隶属于酯酶第六家族.因具有耐盐、较高的热稳定性、高手性选择性,PE8是工业上高效生产手性药物前体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯((R)-3-MFG)很有开发潜力的催化剂,... 详细信息

从深海耐盐杆菌Pelagibacterium halotolerans B2T中分离鉴定的酯酶PE8隶属于酯酶第六家族.因具有耐盐、较高的热稳定性、高手性选择性,PE8是工业上高效生产手性药物前体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯((R)-3-MFG)很有开发潜力的催化剂,但其分子催化机理并不清楚.PE8在大肠杆菌中体外表达,并通过镍柱亲和层析,以及凝胶过滤层析纯化,最终通过悬滴结晶方法获得了PE8蛋白晶体.晶体经过X-ray衍射分析获得1.66的分辨率,属于空间群P21,晶胞参数为a=41.772,b=73.398,c=66.403,β=102.37°.一个异构单元包含2个蛋白分子,溶剂(水)含量为35%.

关键词：酯酶 PE8 结晶

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对转录延伸抑制剂6-氮尿嘧啶敏感的裂殖酵母突变体的全基因组筛选

对转录延伸抑制剂6-氮尿嘧啶敏感的裂殖酵母突变体的全基因组筛选

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2015年上海市研究生学术论坛(生物化工)

作者：周欢刘奇施天仿余垚吕红复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室上海200438 上海市工业菌株工程技术研究中心上海200438 复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室上海200438 上海市工业菌株工程技术研究中心上海200438 上海生物制药技术协同创新中心上海200237

6-氮尿嘧啶(6-azauracil,6AU)是一种被广泛用于研究转录延伸的药物.6AU是一种嘧啶类似物,主要通过其转化产物6-azaUMP发挥作用.6-azaUMP竞争性地抑制乳清酸脱羧酶的活性,降低了体内UTP的浓度.6-azaUMP同时抑制肌苷-5'-单磷酸脱氢酶(...

6-氮尿嘧啶(6-azauracil,6AU)是一种被广泛用于研究转录延伸的药物.6AU是一种嘧啶类似物,主要通过其转化产物6-azaUMP发挥作用.6-azaUMP竞争性地抑制乳清酸脱羧酶的活性,降低了体内UTP的浓度.6-azaUMP同时抑制肌苷-5'-单磷酸脱氢酶(IMP dehydrogenase)的活性,降低了GTP的浓度.在酵母中,核苷酸浓度的降低影响了RN,聚合酶Ⅱ的转录延伸效率.

关键词：

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烟曲霉Asp f3和Asp f4线性B细胞抗原表位最小基序鉴定

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微生物与感染 2016年第4期11卷 240-246页

作者：石晶高岩霍克克季朝能唐海平徐万祥谢毅顾少华复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室上海200438 上海市工业菌株工程技术研究中心上海200438 上海市计划生育科学研究所国家人口和计划生育委员会重点实验室上海200032

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是一种广泛存在于自然界中的条件致病菌,其产生的分生孢子被易感人群吸入后定植于肺部,引起3种曲霉病:致咯血的曲霉肿、致肺纤维化的变应性支气管肺曲霉病、致较高死亡率的侵袭性曲霉病。目前临床上用于... 详细信息

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是一种广泛存在于自然界中的条件致病菌,其产生的分生孢子被易感人群吸入后定植于肺部,引起3种曲霉病:致咯血的曲霉肿、致肺纤维化的变应性支气管肺曲霉病、致较高死亡率的侵袭性曲霉病。目前临床上用于诊断烟曲霉感染的血清免疫学指标有半乳甘露聚糖和1,3-β-D-葡聚糖,但特异度和灵敏度方面存在一定的局限性。Asp f3和Asp f4为烟曲霉主要抗原,在感染者血清中存在相应的循环抗体。本研究分别用兔抗Asp f3和Asp f4抗血清对其进行抗原表位扫描,鉴定了8个Asp f3和6个Asp f4最小表位基序肽。用所鉴定的最小表位基序与烟曲霉其他抗原的最小表位基序构建嵌合肽,可能有助于提高烟曲霉感染诊断的特异度和灵敏度。

关键词：烟曲霉 Asp f3 Asp f4 线性B细胞表位最小基序

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诺如病毒VP1蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达及纯化

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中国病毒病杂志 2022年第1期12卷 35-41页

作者：袁军鸿王晓辉吴萍萍冯昌增周峻岗褚嘉祐吕红杨昭庆昆明医科大学云南昆明650500 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所医学遗传学研究室云南昆明650118 国家药品监督管理局疫苗及生物制品质量控制与评价重点实验室四川成都610097 复旦大学生命科学学院上海工业菌株工程技术研究中心上海200438 复旦大学遗传工程国家重点实验室上海200438

目的使用马克斯克鲁维酵母表达系统对GII.17型诺如病毒病毒样颗粒(VLPs)进行表达并对该蛋白纯化方式进行初步探讨。方法对诺如病毒VP1序列进行密码子优化,使用双酶切构建重组质粒,通过醋酸锂转化法筛选获得重组阳性克隆KM-NOV-GII.17... 详细信息

目的使用马克斯克鲁维酵母表达系统对GII.17型诺如病毒病毒样颗粒(VLPs)进行表达并对该蛋白纯化方式进行初步探讨。方法对诺如病毒VP1序列进行密码子优化,使用双酶切构建重组质粒,通过醋酸锂转化法筛选获得重组阳性克隆KM-NOV-GII.17。摇瓶培养72 h后对菌体进行破碎,使用层析柱对目的蛋白进行纯化,并通过电镜观察颗粒形态。结果成功筛选出高表达量KM-NOV-GII.17,通过Q柱及分子筛串联纯化的方式获得了纯度较高的病毒样颗粒,产量约为0.26 g/L,电镜观察结果显示该VP1序列可自组装为大小均一的病毒样颗粒并且与天然病毒颗粒形态相似。结论本研究证实了GII.17型诺如病毒VP1蛋白可通过马克斯克鲁维酵母表达系统获得产量高、均一性好的病毒样颗粒,这为诺如病毒基因重组疫苗的研发提供了新的蛋白表达系统。

关键词：诺如病毒病毒样颗粒马克斯克鲁维酵母表达纯化

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