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乙型肝炎病毒核心颗粒展示新型冠状病毒刺突蛋白B细胞线性表位及其免疫原性分析

中华微生物学和免疫学杂志 2024年第3期44卷 234-240页

作者：陈小美袁雯婕王世杰王建荣杭小锋万延民王勇翔复旦大学上海医学院基础医学院病原生物学系教育部、卫健委、医科院医学分子病毒学重点实验室上海200032 海军军医大学长征医院感染科上海200003 复旦大学附属华山医院感染科上海市传染病与生物安全应急响应重点实验室国家传染病医学中心上海200040

目的获得展示新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)刺突蛋白B细胞线性表位的乙型肝炎病毒衣壳样颗粒(capsid-like particles,CLPs)并评价其免疫原性。方法将SARS-CoV-2的4条B细胞线性表位(M1、S1-57、S14P5和S21P2)置换乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)第80位丙氨酸。在大肠埃希菌BL21 Star(DE3)中诱导表达这4种线性表位和HBc的重组融合蛋白(M1-HBc、S1-57-HBc、S14P5-HBc和S21P2-HBc)。SDS-PAGE、Western blot和非变性琼脂糖凝胶电泳(native agarose gel electrophoresis,NAGE)鉴定表达产物。蔗糖密度梯度超速离心纯化CLPs并经Western blot验证其抗原性。用纯化的CLPs免疫BALB/c小鼠,通过ELISA测定血清中的抗体滴度。结果重组融合蛋白M1-HBc和S1-57-HBc自组装成M1-CLP和S1-57-CLP,S1-57-CLP免疫小鼠后靶向S1-57多肽的抗体滴度高达1∶1000000。结论在原核系统中成功表达了展示SARS-CoV-2 M1或S1-57线性表位的乙型肝炎病毒CLPs,S1-57-CLP具有良好的免疫原性,为研制SARS-CoV-2新型诊断试剂和疫苗提供了新思路。

关键词：免疫原性新型冠状病毒 B细胞线性表位衣壳样颗粒抗体

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细胞因子在慢性乙型肝炎治疗中的研究进展

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临床肝胆病杂志 2022年第8期38卷 1710-1715页

作者：高子翔沈忠良刘晶谢幼华复旦大学教育部/卫健委/医科院医学分子病毒学重点实验室上海医学院基础医学院病原生物学系上海200032 复旦大学附属华山医院感染科上海市传染病与生物安全应急响应重点实验室国家传染病医学中心上海200040 复旦大学生物医学研究院上海200032 上海市重大传染病和生物安全研究院上海200032

目前,全球范围内仍有约2.5亿人慢性感染HBV,严重威胁人类的生命健康。慢性乙型肝炎(CHB)可进一步发展为肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌等肝脏疾病,而现有的临床抗病毒治疗药物有限,治愈率很低,急需研发新型抗病毒药物。HBV具有强嗜肝性,自... 详细信息

目前,全球范围内仍有约2.5亿人慢性感染HBV,严重威胁人类的生命健康。慢性乙型肝炎(CHB)可进一步发展为肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌等肝脏疾病,而现有的临床抗病毒治疗药物有限,治愈率很低,急需研发新型抗病毒药物。HBV具有强嗜肝性,自然情况下只感染人、黑猩猩等少数灵长类动物。免疫反应(固有免疫与适应性免疫)能否有效识别并清除或抑制HBV是导致病毒感染后不同结局的重要因素。其中,细胞因子发挥了重要的免疫调节作用。本文就一些关键细胞因子在CHB感染及治疗中的研究进展进行了总结与讨论。

关键词：乙型肝炎病毒细胞因子类乙型肝炎,慢性治疗学

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我国甲型肝炎疫苗的研制及应用历程

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国际流行病学传染病学杂志 2021年第4期48卷 334-338页

作者：宋洁玉王松梅汪萱怡复旦大学附属华山医院感染科上海200040 复旦大学生物医学研究院暨教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室上海200032 复旦大学基础医学院医学实验教学中心上海200032 上海市重大传染病和生物安全研究院 200032 复旦大学附属儿科医院上海201102

甲型肝炎是一种古老的疾病,主要通过粪-口途径传播,人群对其普遍易感。甲型肝炎在世界各地均有流行,我国曾属于甲型肝炎高度流行区。1988年,由于江苏吕泗港海域毛蚶被污染,导致上海甲型肝炎大流行,发病率超过4%,总临床病例数高达29.2万... 详细信息

甲型肝炎是一种古老的疾病,主要通过粪-口途径传播,人群对其普遍易感。甲型肝炎在世界各地均有流行,我国曾属于甲型肝炎高度流行区。1988年,由于江苏吕泗港海域毛蚶被污染,导致上海甲型肝炎大流行,发病率超过4%,总临床病例数高达29.2万,之后,在党和政府的大力支持和推动下,我国甲型肝炎疫苗的研制开始加速,并获得了成功,有效地控制了甲型肝炎在我国的流行。

关键词：甲型肝炎疫苗流行模式影响中国免疫消除

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血流感染碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的耐药分析及同源性研究

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微生物与感染 2020年第6期15卷 354-359页

作者：杨思宇徐水宝陈重张文宏金嘉琳陈澍复旦大学附属华山医院感染科上海200040 复旦大学上海医学院基础医学院病原生物学系教育部、卫健委、医科院医学分子病毒学重点实验室上海200030

本研究旨在探讨血流感染碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia,CRKP)的耐药特点、分子分型特征和菌株同源性,为CRKP感染的临床诊治和预防控制提供理论参考。收集2015年4月至2018年3月期间就诊于上海... 详细信息

本研究旨在探讨血流感染碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia,CRKP)的耐药特点、分子分型特征和菌株同源性,为CRKP感染的临床诊治和预防控制提供理论参考。收集2015年4月至2018年3月期间就诊于上海市某三甲医院患者血标本分离的肺炎克雷伯菌(KP)非重复菌株,采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪鉴定细菌并进行药物敏感性试验,共获得51株CRKP。对CRKP菌株使用纸片扩散法或琼脂稀释法进行15种抗菌药物的敏感性试验;采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测碳青霉烯酶基因型;通过脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型(MLST)技术分析菌株同源性。结果显示,51株CRKP对检测的15种临床常用抗菌药物呈广泛耐药,对其中的哌拉西林、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢呋辛、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和环丙沙星耐药率为100%;对阿米卡星、庆大霉素和复方新诺明的耐药率较高,分别为76.5%、90.2%和62.8%;对替加环素耐药率较低,为3.9%。51株CRKP均检测出bla KPC基因,经测序鉴定为bla KPC-2基因,提示产KPC-2是CRKP对碳青霉烯类耐药的主要机制。MLST检测到4种ST型别,以ST11型为主,共43株(84.3%),另有ST15型6株(11.8%),ST4845型1株及1株新分型。51株CRKP的PFGE图谱相似性系数在62.9%~100%,可分为19个簇(A-S簇),每簇分别包含1~12个菌株。其中A簇(13.7%)和G簇(23.5%)包含的菌株相对较多,且MLST分型均为ST11型,为优势簇。G簇包含7个型别,G4型为主要克隆菌株。ST11型为CRKP的主要型别,PFGE分析表明该院存在菌株的克隆传播,应规范抗菌药物使用,同时加强细菌耐药性监测和医院内感染的防控工作。

关键词：抗生素碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌血流感染脉冲场凝胶电泳多位点序列分型同源性

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乙型肝炎病毒Ｘ蛋白的优势氨基酸序列与热点突变位点的生物信息学分析

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微生物与感染 2016年第6期11卷 338-346页

作者：王葳何永刚浦永兰潘少坤谢幼华复旦大学基础医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室太仓市第一人民医院感染科上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔预防科

乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)全长154个氨基酸,与肝癌发生密切相关。为确定HBx的优势氨基酸序列和热点突变位点,在GenBank中下载所有HBx的氨基酸序列13 950条,剔除插入突变、缺失突变和起始密码子非甲硫氨酸的序... 详细信息

乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)全长154个氨基酸,与肝癌发生密切相关。为确定HBx的优势氨基酸序列和热点突变位点,在GenBank中下载所有HBx的氨基酸序列13 950条,剔除插入突变、缺失突变和起始密码子非甲硫氨酸的序列,最后保留7 126条。通过分析这7 126条序列,计算出HBx每个位点的氨基酸分布情况,出现频率最高的氨基酸为该位点的优势氨基酸,其他氨基酸为突变氨基酸。154个位点的优势氨基酸组成HBx优势氨基酸序列。突变率>10.0%的热点突变位点有32个。其中第36、42、44、87、88和127位氨基酸有4种(突变率>1.0%)以上突变形式,具有较高的多态性。与肝癌密切相关的K130M/V131I双突变率为34.7%。通过7 126条HBx序列与优势序列的同源性比较,随机选出其中50条序列(2条与优势序列同源性<75%,48条同源性为76%~99%),与23条参考序列及优势序列共同构建系统发生树。结果显示,HBx优势氨基酸序列属于基因型C,这与基因型C为全球主要流行型一致。本研究首次系统性分析了GenBank中HBx的优势序列,确定了32个HBx热点突变位点和6个多态性较高的位点,为基于HBx突变的基础和应用研究奠定了基础。

关键词：乙型肝炎病毒Ⅹ蛋白热点突变优势序列

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乙型肝炎病毒Ⅹ蛋白的优势氨基酸序列与热点突变位点的生物信息学分析

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微生物与感染 2016年第6期11卷 338-346页

作者：王葳何永刚浦永兰潘少坤谢幼华复旦大学基础医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室上海200032 太仓市第一人民医院感染科太仓215400 上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔预防科上海200011

乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx）全长154个氨基酸,与肝癌发生密切相关.为确定HBx的优势氨基酸序列和热点突变位点,在GenBank中下载所有HBx的氨基酸序列13950条,剔除插入突变、缺失突变和起始密码子非甲硫氨酸的序... 详细信息

乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx）全长154个氨基酸,与肝癌发生密切相关.为确定HBx的优势氨基酸序列和热点突变位点,在GenBank中下载所有HBx的氨基酸序列13950条,剔除插入突变、缺失突变和起始密码子非甲硫氨酸的序列,最后保留7126条.通过分析这7126条序列,计算出HBx每个位点的氨基酸分布情况,出现频率最高的氨基酸为该位点的优势氨基酸,其他氨基酸为突变氨基酸.154个位点的优势氨基酸组成HBx优势氨基酸序列.突变率〉10.0%的热点突变位点有32个.其中第36、42、44、87、88和127位氨基酸有4种（突变率〉1.0%）以上突变形式,具有较高的多态性.与肝癌密切相关的K130M/V131I双突变率为34.7%.通过7126条HBx序列与优势序列的同源性比较,随机选出其中50条序列（2条与优势序列同源性〈75%,48条同源性为76%~99%）,与23条参考序列及优势序列共同构建系统发生树.结果显示,HBx优势氨基酸序列属于基因型C,这与基因型C为全球主要流行型一致.本研究首次系统性分析了GenBank中HBx的优势序列,确定了32个HBx热点突变位点和6个多态性较高的位点,为基于HBx突变的基础和应用研究奠定了基础.

关键词：乙型肝炎病毒X蛋白热点突变优势序列

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一种新乙型肝炎病毒表型耐药分析方法的建立

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中华传染病杂志 2014年第5期32卷 257-262页

作者：李新艳陈良马张妹毛日成黄玉仙张继明上海市公共卫生临床中心肝病科 201508 复旦大学上海医学院教育部、卫生部医学分子病毒学重点实验室复旦大学附属华山医院感染科

目的建立一种新的、简便的HBV表型耐药分析方法,通过置换完整的反转录酶（RT）区研究药物敏感性.方法首先全基因扩增未经核苷（酸）类似物治疗患者的HBV DNA,构建含HBV野毒株全基因组表达质粒PHY536207（B基因型）及PHY97（C基因型）... 详细信息

目的建立一种新的、简便的HBV表型耐药分析方法,通过置换完整的反转录酶（RT）区研究药物敏感性.方法首先全基因扩增未经核苷（酸）类似物治疗患者的HBV DNA,构建含HBV野毒株全基因组表达质粒PHY536207（B基因型）及PHY97（C基因型）,继而在RT区上、下游设计限制酶切位点,改造后的质粒分别命名为mPHY536207及mPHY97.以CHB患者血清中分离到的拉米夫定（LAM）耐药变异株和阿德福韦酯（ADV）耐药变异株为骨架,分别构建LAM耐药株质粒PHY634和ADV耐药株质粒PHY6923,再用耐药株的RT区段取代mPHY536207中的RT区构建重组质粒,命名为RT634（LAM耐药）及RT6923（ADV耐药）.分别用RT区置换前、后的质粒转染Huh7细胞,用ELISA法检测分泌到细胞上清液中的HBsAg水平,用实时PCR和Southern印迹法检测细胞内HBVDNA水平.结果成功构建B型和C型野毒株表达质粒PHY536207和PHY97,经转染Huh7细胞证实有HBV复制能力,6孔细胞培养板中每孔细胞所抽提的HBV DNA均＞1＆#215;107拷贝/mL;在RT区上游设计的Pst Ⅰ酶切位点不影响HBV的表型（HBsAg的表达及HBV DNA的复制）.在PHY634及RT634转染实验中,HBV DNA水平却并未随LAM浓度的升高而明显下降,50％抑制浓度（IC50）＞100 μmol/L,mPHY536207仅为0.18 μmol/L;PHY6923及RT6923转染实验中,HBV DNA对外加的ADV不敏感,IC50＞100 μmol/L,明显高于mPHY536207（1.2 μmol/L）.结论本研究建立了一种新的HBV表型耐药分析方法,可通过RT区置换来研究RT区变异对药物敏感性的影响.

关键词：肝炎病毒,乙型 RNA指导的DNA聚合酶抗药性表型

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中国感染性疾病防治进展10年回顾与展望

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中华内科杂志 2013年第2期52卷 118-120页

作者：张文宏翁心华复旦大学附属华山医院感染科医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室上海200040

近10年来，感染病的疾病谱呈现出独特的景象。重大传染病中的乙型肝炎持续性下降，最新的全国流行病学调查显示，HBsAg携带率为7-18%，处于持续下降中；HIV新发病例正以隐蔽的方式持续增长；结核病的发病率经过长期的努力终于持平，维持... 详细信息

近10年来，感染病的疾病谱呈现出独特的景象。重大传染病中的乙型肝炎持续性下降，最新的全国流行病学调查显示，HBsAg携带率为7-18%，处于持续下降中；HIV新发病例正以隐蔽的方式持续增长；结核病的发病率经过长期的努力终于持平，维持在119/10万的高水平。在这种喜忧参半的大背景下，SARS、甲型H1N1流感以及新型布尼亚病毒感染等新发传染病则间歇性地发出振聋发聩的强音符，显示其重要性。近10年来，不仅仅与之密切相关的微生物学与免疫学基础科学家重新关注感染性疾病的基础研究，其他如分子生物学、基因组学、蛋白质组学、表观遗传学、生物信息学等领域的专家无不开始涉足感染性疾病的研究。

关键词：感染性疾病甲型H1N1流感 HBsAg携带防治中国流行病学调查重大传染病新发传染病

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穿心莲内酯对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞的免疫调节作用

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中华传染病杂志 2010年第4期28卷 226-231页

作者：杨飞飞王维李新艳刘春红瞿涤张继明黄玉仙复旦大学附属山医院感染科上海200040 复旦大学医学分子病毒学教育部卫生部重点实验室

目的探讨穿心莲内酯对体外培养慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血单个核细胞（PBMC）表达Th1细胞因子IFN-γ mRNA及Th2细胞因子IL-4 mRNA和IL-10 mRNA的影响及其抗HBV的活性.方法分别应用穿心莲内酯10mg/L（实验组）及0.1%二甲基亚砜（... 详细信息

目的探讨穿心莲内酯对体外培养慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血单个核细胞（PBMC）表达Th1细胞因子IFN-γ mRNA及Th2细胞因子IL-4 mRNA和IL-10 mRNA的影响及其抗HBV的活性.方法分别应用穿心莲内酯10mg/L（实验组）及0.1%二甲基亚砜（对照组）加入细胞培养液中刺激CHB患者PBMC.不同浓度穿心莲内酯（实验组）及阿德福韦（对照组）刺激HepG2.2.15细胞系,实时荧光定量PCR检测处理后PBMC的IFN-γ tuRNA、IL-4 mRNA及IL-10mRNA表达水平及HepG2.2.15细胞系HBV DNA复制水平.结果穿心莲内酯10 mg/L处理16 h后,实验组PBMC的IFN-γ mRNA表达水平高于对照组（Z=-2.78,P=0.05）,IL-4 mRNA及IL-10 mRNA的表达水平明显低于对照组（Z=-3.82,P〈0.01）,IFN一γ/IL-4 mRNA的比例较对照组明显提高（Z=-3.82,P〈0.01）,不同浓度穿心莲内酯对HepG2.2.15细胞系HBV DNA复制无明显影响（t=11.88,P〉0.05）,而阿德福韦对HBV DNA有抑制作用（t=15.95,P〈0.05）.结论穿心莲内酯对CHB患者PBMC内IFN一γ mRNA、IL-4 mRNA及IL-10 mRNA的表达水平有调节作用,改善Th1/Th2平衡,对HBV DNA无直接抑制作用.

关键词：穿心莲内酯肝炎,乙型,慢性单核细胞 Th1细胞 Th2细胞白细胞介素4 白细胞介素10

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