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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2022年第5期40卷 579-586页

作者：李佳铭王艺璇杨宁爱马慧慧兰敏刘春兰赵志军宁夏医科大学临床医学院银川750004 宁夏病原微生物重点实验室银川750004 宁夏医科大学总医院医学实验中心银川750004

目的探究刚地弓形虫棒状体蛋白16 (ROP16)在小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)中的表达及其对细胞极化和凋亡的影响和相关机制。方法利用携带绿色荧光标签的ROP16过表达慢病毒转染MH-S细胞,构建稳定表达ROP16的ROP16-MH-S细胞株(过表达组),... 详细信息

目的探究刚地弓形虫棒状体蛋白16 (ROP16)在小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)中的表达及其对细胞极化和凋亡的影响和相关机制。方法利用携带绿色荧光标签的ROP16过表达慢病毒转染MH-S细胞,构建稳定表达ROP16的ROP16-MH-S细胞株(过表达组),同时设空载体慢病毒转染对照组(空载体组)和无转染对照组(对照组)。转染72 h后免疫荧光法检测ROP16-MH-S中ROP16的表达及其在细胞中的定位。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的转录水平为内参照,RT-qPCR检测ROP16-MH-S细胞中促炎(M1)因子白细胞介素-1β (IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、 IL-18、 IL-6、 IL-12和抗炎(M2)因子IL-10、转化生长因子-β(TGF-β),以及抑凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2 (Bcl-2)和促凋亡基因Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3 (Caspase 3)、 Caspase 9等mRNA的相对转录水平;Western blotting检测ROP16-MH-S细胞中极化蛋白精氨酸酶1 (Arg-1)、信号转导和转录激活因子3 (STAT3)、 705位点磷酸化(pTyr705)-STAT3、 STAT6、 pTyr641-STAT6和凋亡蛋白Caspase 9、 Caspase 3、 Bcl-2、 Bax蛋白的相对表达水平;流式细胞术检测ROP16-MH-S细胞的凋亡情况。组间比较采用单因素方差分析。结果转染后72 h,空载体组和过表达组90%以上的细胞可见较强的绿色荧光,过表达组细胞中可见明显红色荧光聚集在ROP16-MH-S细胞核及其周围。RT-qPCR结果显示,过表达组ROP16 mRNA的相对转录水平为8 023.459±39.325,高于空载体组(5.540±0.001)(F=83 188, P <0.01);Western blotting检测结果显示,过表达组ROP16蛋白的相对表达水平为16.349±0.746,高于空载体组(1.291±0.333)(F=831.7, P <0.01)。RT-qPCR结果显示,过表达组促炎(M1)因子IL-1β、 TNF-α、 IL-18、IL-6、 IL-12 m RNA的相对转录水平分别为0.495±0.002、 0.337±0.007、 0.378±0.014、 0.474±0.035和0.730±0.021,均低于空载体组(0.994±0.043、 1.165±0.034、 0.943±0.005、 1.153±0.028、 0.926±0.031)(F=261.7、 536.5、 1 682.0、 225.0、 78.5, P <0.01);抗炎(M2)因子IL-10、 TGF-β mRNA的相对转录水平分别为7.013±0.032和1.608±0.024,均高于空载体组(0.790±0.031、 1.091±0.027)(F=23 835.0、 200.1, P <0.01)。Western blotting检测结果显示,过表达组Arg-1、 pTyr705-STAT3、 pTyr641-STAT6蛋白相对表达水平分别为2.337±0.089、 3.471±0.046、 3.905±0.045,均高于空载体组(0.871±0.014、 1.482±0.071、 1.514±0.050)(F=640.8、 1 608.0、 3 528.0, P <0.01)。流式细胞术检测结果显示,过表达组细胞凋亡率为(2.990±0.042)%,低于对照组(6.480±0.071)%和空载体组(5.655±0.290)%(F=219.7, P <0.01)。Western blotting检测结果显示,过表达组促凋亡蛋白Bax、 Caspase 3、 Caspase 9的相对表达水平分别为0.558±0.005、 0.640±0.011、0.593±0.026, Bax/Bcl-2为0.453±0.011,均低于空载体组(0.991±0.010、 0.926±0.006、 0.963±0.012、0.834±0.008)(F=2 850.0、 1 200.0、 359.3、 2 337.0, P <0.01)。RT-qPCR检测结果显示,过表达组促凋亡基因Bax、 Caspase 3、 Caspase 9 mRNA的相对转录水平分别为0.588±0.086、 0.563±0.025和0.403±0.014, Bax/Bcl-2为0.158±0.008,均低于空载体组(0.924±0.016、 0.937±0.041、 0.807±0.032、 0.779±0.014)(F=24.7、 78.6、 154.9、 26

关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白16 小鼠肺泡巨噬细胞凋亡信号转导和转录激活因子3/6

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OPN siRNA慢病毒载体的构建及其对大肠癌细胞增殖的抑制作用

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基础医学与临床 2014年第3期34卷 350-354页

作者：邢译文白静范维宁刘鑫周林林徐广贤宁夏医科大学检验学院宁夏银川750004 宁夏医科大学总医院医学实验中心宁夏银川750004

目的构建OPN-siRNA的慢病毒载体,探讨其对结肠癌SW480细胞增殖的调节作用。方法设计合成针对OPN的siRNA序列,退火形成双链DNA并克隆到pSicoR质粒后,包装重组慢病毒。应用Real-time PCR及Western blot检测病毒刺激SW480细胞后OPN的mRNA... 详细信息

目的构建OPN-siRNA的慢病毒载体,探讨其对结肠癌SW480细胞增殖的调节作用。方法设计合成针对OPN的siRNA序列,退火形成双链DNA并克隆到pSicoR质粒后,包装重组慢病毒。应用Real-time PCR及Western blot检测病毒刺激SW480细胞后OPN的mRNA和蛋白的表达水平,应用MTT法检测慢病毒对SW480细胞增殖的调节作用。结果成功构建了携带OPN-siRNA的重组慢病毒。该重组慢病毒可使SW480细胞内OPN的mRNA和蛋白的表达降低,LV-siRNA-OPN慢病毒对SW480细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05)。结论成功构建的LVsiRNA-OPN慢病毒可以有效抑制SW480细胞内OPN的mRNA和蛋白表达,并抑制SW480细胞的增殖。

关键词： OPN siRNA 慢病毒 SW480细胞

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黄芪甲苷减轻环磷酰胺诱导的早发性卵巢功能不全模型大鼠卵巢炎症反应

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中国病理生理杂志 2023年第4期39卷 684-693页

作者：邢莎莎虎娜田瑞莹罗斌锁小娟刘文钊罗嘉琦陈苗杨丽陈冬梅马会明宁夏医科大学基础医学院宁夏银川750004 宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室宁夏银川750004 宁夏医科大学中医学院宁夏银川750004 宁夏医科大学实验动物中心宁夏银川750004 宁夏医科大学总医院宁夏干细胞与再生医学重点实验室宁夏银川750004

目的:研究黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-IV)是否通过抑制核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路降低环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)诱导的早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)模型大鼠炎症反应。方法:动情周期正常的雌性SD大鼠80只,选取12只为正常对照组,其余68只大鼠用CTX腹腔注射诱导建立POI模型。将模型制备成功的60只大鼠随机分为5组,每组12只,分别为POI模型组、芬吗通组、低剂量AS-IV组、中剂量AS-IV组和高剂量AS-IV组,干预28 d后取样。采用ELISA法测定血清中17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)、抗缪勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone,LH)水平;转录组测序筛选差异表达基因及功能富集;HE染色法观察卵巢组织病理变化并进行卵泡计数;免疫组织化学染色法和Western blot法分别进行p65(胞核)、p-p65和p-IκBα及下游促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α及IL-8的定位表达和相对表达水平检测。结果:用CTX诱导15 d建立的POI模型大鼠动情周期紊乱;与正常对照组相比,POI模型大鼠血清17β-E2和AMH显著降低、FSH和LH显著升高(P<0.01)。经各组相应干预28 d后,与POI模型组相比,中剂量AS-IV组大鼠血清17β-E2和AMH水平升高、FSH和LH水平降低,差异显著(P<0.01)。基于转录组测序结果发现,POI模型组与中剂量AS-IV组有274个差异表达基因,富集在炎症相关功能基因簇。HE染色显示,与正常对照组相比,POI模型组大鼠卵巢组织结构紊乱,初级卵泡和成熟卵泡数目减少,闭锁卵泡数目增多(P<0.01);与POI模型组相比,中剂量AS-IV组大鼠卵巢组织初级卵泡和成熟卵泡数目增多(P<0.01)。芬吗通治疗后初级卵泡数量较模型组没有差异,可见的有腔卵泡数量较模型组增多,但多为闭锁卵泡。与正常对照组相比,POI模型组p65(胞核)、p-p65、p-IκBα、IL-6、IL-1β、TNF-α及IL-8的蛋白表达量显著升高(P<0.05);与POI模型组相比,芬吗通组和中剂量AS-IV组p65(胞核)、p-p65/p65、p-IκBα、IL-6、IL-1β、TNF-α及IL-8的蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论:AS-IV可能通过介导NF-κB信号通路抑制卵巢炎症反应,从而改善CTX诱导的POI模型大鼠的卵巢形态结构和功能。

关键词：早发性卵巢功能不全黄芪甲苷核因子κB 环磷酰胺

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LncRNA 017418及细胞因子在细粒棘球蚴rP29免疫小鼠中的表达分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2020年第2期38卷 201-206页

作者：王婵杨松昊董飞杜先才杨继辉牛楠朱明星王浩王娅娜赵巍宁夏医科大学基础医学院银川750004 宁夏医科大学医学科学技术研究中心银川750004 宁夏医科大学基础医学院病原与免疫教研室银川750004 宁夏医科大学基础医学院遗传与细胞生物教研室银川750004

目的初步探讨长链非编码RNA 017418(lncRNA 017418)和细胞因子在细粒棘球蚴重组蛋白P29(rP29)诱导小鼠产生免疫反应中的表达。方法重组融合表达菌株pET28a-P29/BL21与LB液体培养基混合孵育,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达... 详细信息

目的初步探讨长链非编码RNA 017418(lncRNA 017418)和细胞因子在细粒棘球蚴重组蛋白P29(rP29)诱导小鼠产生免疫反应中的表达。方法重组融合表达菌株pET28a-P29/BL21与LB液体培养基混合孵育,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯化rP29。36只雌性BALB/c小鼠随机分为对照组、佐剂组和免疫组,每组12只,免疫组将纯化的10μg rP29与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后,腹部皮下3点注射,总剂量100μl/鼠,佐剂组注射等体积弗氏完全佐剂,对照组不作处理;首次免疫后2周,相同剂量加强免疫1次,加强免疫采用弗氏不完全佐剂。加强免疫后2周,无菌环境下制备脾细胞悬液,分离淋巴细胞;流式细胞术分选淋巴细胞亚群CD4^+T、CD8^+T和B淋巴细胞;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测lncRNA 017418、Notch1、白细胞介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-10在淋巴细胞中的表达量;采用SPSS 17.0统计学软件和GraphPad Prism6.0软件对实验结果进行分析。结果经IPTG诱导表达、亲和层析法纯化,rP29蛋白相对分子质量(Mr)约为31000。qRT-PCR检测lncRNA 017418在脾淋巴细胞中的相对表达量,免疫组为2.25±0.10,高于对照组(0.81±0.05)和佐剂组(0.99±0.13)(P<0.01)。流式细胞术分析的CD4^+T、CD8^+T和B淋巴细胞所占比例分别为:对照组22.0%、9.2%和59.8%,佐剂组22.8%、7.6%和60.7%,免疫组22.1%、9.7%和60.4%。LncRNA 017418在免疫组CD4^+T淋巴细胞中的相对表达量为1.49±0.03,高于对照组(0.97±0.02)和佐剂组(1.06±0.10)(P<0.01),LncRNA 017418在免疫组CD8^+T细胞中的相对表达量为1.87±0.12,与对照组(2.06±0.14)和佐剂组(2.00±0.09)相比,差异无统计学意义(P>0.05),LncRNA 017418在免疫组B淋巴细胞中的相对表达量为1.03±0.03,与对照组(0.97±0.07)和佐剂组(1.08±0.12)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。Notch1在免疫组CD4+T淋巴细胞中的相对表达量为1.92±0.04,高于对照组(1.10±0.10)和佐剂组(1.20±0.08)(P<0.01),IL-2的相对表达量为1.45±0.07,高于对照组(1.07±0.08)和佐剂组(1.09±0.11)(P<0.05);IFN-γ的相对表达量为1.51±0.11,高于对照组(0.92±0.05)和佐剂组(1.03±0.14)(P<0.01、0.05);IL-10的相对表达量为0.52±0.01,低于对照组(0.95±0.04)和佐剂组(1.05±0.10)(P<0.01);对照组和佐剂组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关系数分析lncRNA 017418与Notch1、IL-2、IFN-γ之间存在正相关关系(r=0.8244、0.5902、0.8415,均P<0.01),与IL-10之间存在负相关关系(r=-0.4432,P<0.05)。结论LncRNA 017418在细粒棘球蚴rP29诱导的小鼠中表达上调,Notch1、IL-2、IFN-γ在CD4+T淋巴细胞中表达上调,IL-10在CD4+T淋巴细胞中表达下调。

关键词：重组蛋白P29 CD4^+T淋巴细胞长链非编码RNA 017418 免疫保护

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宁夏地区回族女性散发性乳腺癌易感基因BRCA1/BRCA2突变的研究

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临床检验杂志 2011年第4期29卷 295-297页

作者：康毓芝杨宝珍陈耀平师志云尹琳琳宁夏医科大学检验学院银川750004 宁夏医科大学附属医院医学实验中心银川750004

目的研究宁夏地区回族女性散发性乳腺癌中BRCA1/BRCA2基因(breast cancer susceptibility gene 1/2)的突变位点及携带情况。方法收集60例回族居民乳腺癌石蜡包埋组织标本及15例乳腺小叶增生或纤维腺瘤标本。PCR和DNA直接测序法检测BRCA... 详细信息

目的研究宁夏地区回族女性散发性乳腺癌中BRCA1/BRCA2基因(breast cancer susceptibility gene 1/2)的突变位点及携带情况。方法收集60例回族居民乳腺癌石蜡包埋组织标本及15例乳腺小叶增生或纤维腺瘤标本。PCR和DNA直接测序法检测BRCA1基因第2、11和20号外显子和BRCA2基因第11号部分外显子突变情况。结果 60例乳腺癌BRCA1基因有10例突变,突变率为16.7%,突变位点均位于BRCA1基因。15例对照均未检出突变且淋巴结转移与未转移组间BRCA1基因突变率差异(30.8%与5.9%)有统计学意义(P<0.05)。结论 BRCA1基因突变可能与宁夏回族女性乳腺癌发生相关。

关键词：乳腺癌 BRCA1基因 BRCA2基因 DNA测序突变

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模式识别受体NOD2在髓样分化蛋白88缺陷小鼠抗分枝杆菌感染中的作用机制

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中国感染与化疗杂志 2019年第1期19卷 38-41页

作者：梁锦屏陈少红张倩汤业珍韩怀钦魏军宁夏医科大学基础医学院银川750004 宁夏医科大学总医院临床病原生物重点实验室

目的探讨模式识别受体NOD2信号在髓样分化蛋白88缺陷(MyD88-/-)小鼠中的表达与免疫功能。方法通过PCR技术鉴定MyD88^(-/-)小鼠、野生型C57BL/6小鼠,分别用分枝杆菌减毒株(卡介苗,BCG)经气管滴入建立肺部感染模型,以磷酸缓冲盐溶液(PBS)... 详细信息

目的探讨模式识别受体NOD2信号在髓样分化蛋白88缺陷(MyD88-/-)小鼠中的表达与免疫功能。方法通过PCR技术鉴定MyD88^(-/-)小鼠、野生型C57BL/6小鼠,分别用分枝杆菌减毒株(卡介苗,BCG)经气管滴入建立肺部感染模型,以磷酸缓冲盐溶液(PBS)气管滴入为阴性对照,感染24h后,收集外周血,无菌取肺脏。利用荧光定量PCR技术、Western Blot技术检测小鼠中NOD2基因与蛋白的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测小鼠外周血中白介素6(IL-6)含量。结果与PBS对照组相比,BCG感染组NOD2蛋白表达量显著升高;而MyD88^(-/-)小鼠相比野生型小鼠NOD2蛋白表达量更高;两种小鼠中BCG感染组均比PBS对照组NOD2蛋白表达量更高;两种小鼠中BCG感染后外周血IL-6的含量比PBS对照组高,差异有统计学意义。结论 MyD88依赖途径功能缺失时,BCG可激活NOD2信号通路。

关键词：结核分枝杆菌卡介苗模式识别受体NOD2 髓样分化蛋白88 白介素6

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基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜对肌红蛋白的吸入及其电化学研究

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高等学校化学学报 2016年第5期37卷 938-945页

作者：姚惠琴黄珊苏巧玲史可人甘倩倩王明科宁夏医科大学药学院基础医学院银川750004 宁夏大学能源化工国家重点实验室银川750021

合成了既含有苯硼酸(PBA)基团又含有羧酸基团的聚电解质PAA-PBA(PAA:聚丙烯酸).采用层层组装(Lb L)技术,利用PAA-PBA和葡聚糖(Dex)之间的硼酸-二醇特异性识别作用,在热解石墨电极(PG)表面构筑了{PAA-PBA/Dex}_nLb L薄膜,该薄膜从溶液中... 详细信息

合成了既含有苯硼酸(PBA)基团又含有羧酸基团的聚电解质PAA-PBA(PAA:聚丙烯酸).采用层层组装(Lb L)技术,利用PAA-PBA和葡聚糖(Dex)之间的硼酸-二醇特异性识别作用,在热解石墨电极(PG)表面构筑了{PAA-PBA/Dex}_nLb L薄膜,该薄膜从溶液中吸入肌红蛋白(Mb)形成{PAA-PBA/Dex}_n-Mb薄膜.采用循环伏安方法研究了{PAA-PBA/Dex}_n薄膜中Mb的直接电化学及对氧气和过氧化氢的电催化还原过程.结果表明,该薄膜为保持Mb的生物活性提供了良好的微环境,是一种新型的可固定蛋白质的Lb L薄膜,为设计基于酶的直接电化学生物传感器提供了新思路.

关键词：直接电化学电催化层层组装硼酸-二醇特异性识别作用肌红蛋白

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苦参碱和槐定碱在多刺激响应性水凝胶薄膜电极上的可调控电化学行为及其逻辑门构建

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高等学校化学学报 2019年第4期40卷 685-692页

作者：吴雪梅韦洁许红平左玲霞单晓艳姚惠琴郑志祥宁夏医科大学药学院银川750004 宁夏医科大学基础医学院银川750004 甘肃政法学院甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室兰州730070

采用苦参碱(Matrine,MT)和槐定碱(Sophoridine,SR)作为电活性药物分子探针,考察了聚(N-异丙基)丙烯酰胺(PNIPAM)水凝胶薄膜的刺激响应特性;并通过循环伏安(CV)法和扫描电子显微镜(SEM)研究了PNIPAM在不同外界刺激条件(如温度、盐浓度和... 详细信息

采用苦参碱(Matrine,MT)和槐定碱(Sophoridine,SR)作为电活性药物分子探针,考察了聚(N-异丙基)丙烯酰胺(PNIPAM)水凝胶薄膜的刺激响应特性;并通过循环伏安(CV)法和扫描电子显微镜(SEM)研究了PNIPAM在不同外界刺激条件(如温度、盐浓度和甲醇)下结构的改变.在25℃时,药物分子MT和SR在玻碳电极上产生较大的氧化峰电流,随着温度升高至40℃,药物分子探针的氧化峰电流逐渐减小.考察了不同Na_2SO_4浓度和不同比例甲醇对PNIPAM水凝胶薄膜的影响,发现MT和SR的氧化峰电流随着Na_2SO_4浓度(0～0. 45 mol/L)和甲醇比例(0～40%)的升高而减小.结果表明,MT和SR可作为分子探针研究PNIPAM水凝胶薄膜对环境的三重刺激响应性开关行为,并可进一步构筑3-输入/2-输出的逻辑门系统.

关键词：苦参碱槐定碱聚(N-异丙基)丙烯酰胺可调控逻辑门

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细粒棘球绦虫蛋白Actin-binding LIM protein 1的生物信息学分析

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中国病原生物学杂志 2023年第3期18卷 297-302页

作者：钱炳硕张婷婷王明霞朱明星宁夏医科大学总医院宁夏银川750004 宁夏常见传染病防治重点实验室宁夏医科大学临床医学院宁夏医科大学基础医学院宁夏医科大学科技中心

目的对细粒棘球绦虫肌动蛋白结合LIM蛋白1(Actin-binding LIM protein 1,AbLIM1)进行生物信息学预测,以期为包虫病的诊断治疗积累研究资料。方法通过NCBI数据库获取EgAbLIM1的氨基酸序列;使用在线软件分析蛋白质的理化性质、二级结构、... 详细信息

目的对细粒棘球绦虫肌动蛋白结合LIM蛋白1(Actin-binding LIM protein 1,AbLIM1)进行生物信息学预测,以期为包虫病的诊断治疗积累研究资料。方法通过NCBI数据库获取EgAbLIM1的氨基酸序列;使用在线软件分析蛋白质的理化性质、二级结构、三级结构,并对其亚细胞定位、蛋白质结构以及抗原表位进行预测;使用GEPIA2.0数据库预测编码EgAbLIM1基因的相关基因,使用DAVID数据库以及R语言进行GO功能和KEGG通路富集分析。结果EgAbLIM1由753个氨基酸组成,理论等电点为9.51;EgAbLIM1的二级结构中α螺旋占22.05%,延伸链占12.62%,β-转角占5.44%,无规卷曲占59.89%。优势B细胞表位肽有6条,优势HLA-DRB1*0401限制性Th表位位置为572-584位氨基酸;优势HLA-DRB1*0701限制性Th表位位置为247-261、504-511位氨基酸。分子生物学功能相关程度最高的是钙黏连结合(cadherin binding)、参与细胞-细胞粘附的钙黏连结合(cadherin binding involved in cell-cell adhesion)、细胞-细胞粘附介质的活性(cell-cell adhesion mediator activity)等。结论生物信息学方法预测细粒棘球绦虫AbLIM1含有多个抗原表位并对其关联基因进行了富集分析,为包虫病的诊断和药物治疗靶点筛选提供理论依据。

关键词：细粒棘球绦虫肌动蛋白结合LIM蛋白1 生物信息学分析抗原表位

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铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA0575对表型的影响

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微生物学通报 2020年第6期47卷 1927-1934页

作者：詹学良姚严翔芦晓红郭嘉义黄卫东宁夏医科大学基础医学院宁夏银川750000 宁夏医科大学科技中心宁夏银川750000

【背景】铜绿假单胞菌PAO1中存在与环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)代谢相关基因PA0575。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PA0575对运动能力及生物膜的影响。【方法】通过PCR对菌株... 详细信息

【背景】铜绿假单胞菌PAO1中存在与环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)代谢相关基因PA0575。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PA0575对运动能力及生物膜的影响。【方法】通过PCR对菌株遗传背景进行确认;利用刚果红结合实验及电转PcdrA-gfp质粒间接测量胞内c-di-GMP水平;利用泳动性(swimming)、蜂群泳动(swarming)、蹭行运动(twiching)和生物膜定量实验对细菌进行表型分析,并在运动培养基中添加抗生素研究其对运动能力的影响;针对PA0575基因进行融合蛋白表达载体的构建,并对蛋白进行原核诱导表达。【结果】3株突变体菌株的转座子插入突变位点不一致,胞内c-di-GMP水平检测结果显示,PA0575-1菌株的c-di-GMP含量高于野生型PAO1菌株(P<0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株胞内c-di-GMP水平与野生型PAO1菌株无差异(P>0.05)。运动能力检测实验中,与野生型PAO1菌株相比,PA0575-1菌株泳动性增强(P<0.05);PA0575-2、PA0575-3菌株的泳动性、蜂群运动均增强(P<0.05);该基因不同位点的突变均导致氯霉素对菌株的运动能力产生抑制作用。生物膜定量结果显示,与野生型PAO1菌株相比,细菌培养18 h后PA0575-1的生物膜含量降低(P<0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株的生物膜含量升高。最后成功构建了PA0575基因不同结构域的8个表达载体,并获得了异源表达蛋白。【结论】PA0575基因降低铜绿假单胞菌胞内c-di-GMP的水平,影响表型的同时也抑制了氯霉素抗性基因的表达。以上研究为PA0575基因对表型的影响奠定了基础。

关键词： GGDEF/EAL结构域 PA0575转座子突变体铜绿假单胞菌PAO1 环鸟苷二磷酸

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