检索结果-内蒙古大学图书馆

微生物学通报 2025年

作者：崔珂玮柯航李哲李皓男李佳宇李敏崔桐彤高佳音何琪赵鹏杰简硕果祁克宗宋祥军王振宇邵颖涂健安徽农业大学动物医学院兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室

【背景】禽大肠杆菌病可导致禽类多种炎症和败血症，严重影响禽只健康，对养禽业构成严重威胁。传统防治手段存在诸多局限，迫切需要寻找新的防控药物。【目的】本研究旨在研发禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli， A... 详细信息

【背景】禽大肠杆菌病可导致禽类多种炎症和败血症，严重影响禽只健康，对养禽业构成严重威胁。传统防治手段存在诸多局限，迫切需要寻找新的防控药物。【目的】本研究旨在研发禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli， APEC）感染的临床有效防控药物，通过体外表达获得重组禽β防御素6（AvBD-6）和重组禽β防御素9（AvBD-9），并评价其抗APEC感染的效果。【方法】根据GenBank数据库获得AvBD-6和AvBD-9的基因序列，优化密码子后克隆至pET-28a表达载体，转化至BL21（DE3）PLysS感受态细胞进行蛋白表达，利用SDS-PAGE和Western blotting技术鉴定表达的蛋白，通过磁珠法纯化目的蛋白；分别通过肌肉注射禽致病性大肠杆菌菌液建立SPF雏鸡感染模型，再分别肌肉注射AvBD-6和AvBD-9进行抗病原感染试验，最后对各试验组雏鸡进行剖检观察病理变化、制作病理切片、测定脏器指数和检测脏器载毒量。【结果】成功构建了pET-28a-AvBD-6和pET-28a-AvBD-9表达载体，经诱导表达的分子量分别约为21 kDa和25 kDa且主要在上清中表达，纯化后的重组蛋白浓度分别约为316 μg/mL和282 μg/mL；在SPF雏鸡的APEC感染模型中，应用AvBD-6和AvBD-9后体重恢复，能有效缓解肝脏损伤，降低雏鸡脏器细菌载量【结论】AvBD-6和AvBD-9蛋白对APEC感染具有明显的抑制作用，能够显著降低这种病原体在鸡体内的载量、减轻其对机体的损伤程度，为临床寻找防治APEC病原感染的药物提供数据支持。

关键词：重组禽β防御素6 重组禽β防御素9 禽致病性大肠杆菌 SPF鸡

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禽4型腺病毒单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

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畜牧兽医学报 2025年第5期56卷 2364-2371页

作者：张宇程凡玉俞赵荣邵颖魏宁波陈芳芳王振宇宋祥军涂健祁克宗安徽农业大学动物医学院兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室合肥230036

本研究旨在制备禽4型腺病毒(fowl adenovirus type 4,FAdV-4)的单克隆抗体,鉴定其特异性结合位点,并评估其在免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和免疫沉淀反应中的应用价值。使用纯化的FAdV-4-AH-F41株全病毒免疫小鼠,通过间接酶联免... 详细信息

本研究旨在制备禽4型腺病毒(fowl adenovirus type 4,FAdV-4)的单克隆抗体,鉴定其特异性结合位点,并评估其在免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和免疫沉淀反应中的应用价值。使用纯化的FAdV-4-AH-F41株全病毒免疫小鼠,通过间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法筛选出一株阳性杂交瘤细胞并进行亚克隆,并对所制备的单克隆抗体进行效价检测。利用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)与蛋白免疫印迹(Western blot)方法鉴定单克隆抗体生物学特性,构建了pCold TF-Hexon、pET-32a(+)-Fiber1、pCold TF-Penton、pCold TF-Fiber2的原核表达载体,并通过Western blot初步鉴定所得单克隆抗体的特异性结合位点,在检测出抗体的亚型后,将其初步应用于IHC和免疫沉淀试验。结果表明本试验获得1株稳定分泌抗Fiber1蛋白的单克隆抗体,并将其命名为5C7。该抗体效价为1∶102400,亚型为IgG-2b,表现出良好的生物学特性。在IHC中,能够观察到明显的病变特征;在免疫沉淀试验中,5C7可作为捕获抗体,与病毒感染细胞中的Fiber1蛋白特异性结合。结果提示,本试验通过全病毒粒子免疫小鼠所制备的单克隆抗体能够特异性识别Fiber1蛋白,并在IHC和免疫沉淀反应中显示出良好的应用前景,为FAdV-4实验室病理诊断方法的建立和Fiber1蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：血清4型禽腺病毒单克隆抗体抗体鉴定 Fiber1蛋白 IHC 免疫共沉淀

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基于PfAgo技术的猪细小病毒快速检测方法的建立

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安徽农业大学学报 2024年第6期51卷 1013-1021页

作者：吴崇铤苟婧萱兰守信张曼琪涂健王振宇邵颖宋祥军安徽农业大学动物医学院/兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室合肥230036

为了将优化的PfAgo荧光法与环介导等温扩散(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术相结合,建立灵敏、快速、特异的猪细小病毒(porcine pavovirus,PPV)检测方法,针对PPV保守序列VP2分别筛选gDNA并设计对应的分子信标,初步建... 详细信息

为了将优化的PfAgo荧光法与环介导等温扩散(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术相结合,建立灵敏、快速、特异的猪细小病毒(porcine pavovirus,PPV)检测方法,针对PPV保守序列VP2分别筛选gDNA并设计对应的分子信标,初步建立基于PfAgo的荧光检测法,在同靶位筛选LAMP的引物并对其扩增条件进行优化,将两者结合探究其敏感性和特异性,最后使用优化后的方法对临床样本进行检测。结果表明PfAgo荧光检测法最佳反应温度为95℃,最佳引物使用量为750 pmol,分子信标最佳使用量为15 pmol,最佳反应时间为30 min,PfAgo荧光检测法具有高度的专一性。LAMP检测法筛选出最佳扩增温度为61℃,最适反应时间为40 min,dNTP最佳终浓度为1.2 mmol·L^(-1),锰离子最佳终浓度为10 mmol·L^(-1),最适内外引物比例为4∶1,其灵敏度可达101 copies·µL^(-1),与其他检测样本无交叉反应、特异性良好。将LAMP和PfAgo荧光检测法相结合后,其灵敏度可达101 copies·µL^(-1),特异性试验结果表明该方法专一性强。研究建立的PPV-LAMP-PfAgo荧光法,灵敏性高、特异性强,具备灵敏、快速等优点,为临床基层检测PPV提供一种新的技术手段。

关键词： PfAgo 猪细小病毒环介导等温扩增快速检测

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阪崎克罗诺杆菌双抗夹心酶联免疫吸附检测方法的建立

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畜牧与兽医 2024年第4期56卷 66-71页

作者：张欣王福成韩先干祁克宗宋祥军董雨豪蒋蔚中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 安徽农业大学兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽合肥230036

为建立阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)的免疫学快速检测方法,分别制备了阪崎克罗诺杆菌的特异性单抗和多抗,建立阪崎克罗诺杆菌的双抗夹心酶联免疫吸附DAS-ELISA检测方法。结果:获得4株抗阪崎克罗诺杆菌单克隆抗体阳性细胞株,... 详细信息

为建立阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)的免疫学快速检测方法,分别制备了阪崎克罗诺杆菌的特异性单抗和多抗,建立阪崎克罗诺杆菌的双抗夹心酶联免疫吸附DAS-ELISA检测方法。结果:获得4株抗阪崎克罗诺杆菌单克隆抗体阳性细胞株,分泌抗体效价分别是1∶128000、1∶32000、1∶256000和1∶256000,抗阪崎克罗诺杆菌兔多克隆抗体效价是1∶128000。建立的阪崎克罗诺杆菌DAS-ELISA检测方法,分别以抗阪崎克罗诺杆菌兔多抗和单抗作为捕获抗体和检测抗体,兔多抗的最佳稀释度为1∶4000,单克隆抗体最佳稀释度为1∶1000,灵敏性可达1×106 CFU/mL;该检测方法具有良好的特异性,与常见的6种食源性病原菌都没有交叉反应,且能够同时检测6种克罗诺杆菌属细菌;重复性结果显示,该检测方法的批内批间变异系数均小于15%,具有良好的重复性。综上,利用抗阪崎克罗诺杆菌的单抗和兔多抗成功建立了DAS-ELISA方法,该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可为阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供技术支撑。

关键词：阪崎克罗诺杆菌单克隆抗体双抗体夹心ELISA

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细胞与分子免疫学杂志 2022年第9期38卷 842-847页

作者：刘丹于胜祖方天王蓓张淼吕炫祝萌王晴王桂军安徽农业大学动物科技学院预防兽医学科安徽合肥230036 兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽合肥230036

目的以纯化的内质网相关的干扰素诱导病毒抑制蛋白(viperin)免疫小鼠制备其多克隆抗体并鉴定其特异性。方法对BALB/c小鼠颅内注射鸭坦布苏病毒,刺激小鼠脑组织产生viperin,通过反转录PCR从小鼠大脑组织克隆viperin,并将其插入至pGEX-6P-... 详细信息

目的以纯化的内质网相关的干扰素诱导病毒抑制蛋白(viperin)免疫小鼠制备其多克隆抗体并鉴定其特异性。方法对BALB/c小鼠颅内注射鸭坦布苏病毒,刺激小鼠脑组织产生viperin,通过反转录PCR从小鼠大脑组织克隆viperin,并将其插入至pGEX-6P-1原核表达载体,转化至大肠杆菌Rosetta。用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对重组蛋白诱导表达,对其进行可溶性分析,以氯化钾染色切胶法对大量表达蛋白进行纯化;将纯化的重组viperin蛋白经腹部皮下免疫小鼠制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定多抗效价,Western blot法和间接免疫荧光法(IFA)检测BHK-21仓鼠肾成纤维细胞瞬时表达的viperin蛋白鉴定viperin抗体的特异性和敏感性。结果成功克隆并表达小鼠viperin基因,制备的抗体效价可达1∶25600,小鼠抗viperin多克隆抗体可特异性识别BHK-21细胞表达的viperin蛋白。结论成功制备特异性较好的小鼠抗viperin多克隆抗体。

关键词：内质网相关的干扰素诱导病毒抑制蛋白(viperin) 原核表达多克隆抗体

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鸭坦布苏病毒囊膜糖蛋白结构域3(ED3)单克隆抗体的制备及其中和活性分析

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细胞与分子免疫学杂志 2022年第10期38卷 931-938页

作者：张淼吕炫张冲阚莹王若洁于胜祖卢奇祝萌方天刘丹朱英奇曹守林王蓓殷冬冬王晴王桂军安徽农业大学动物科技学院预防兽医学科安徽合肥230036 兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽合肥230036

目的以纯化的重组鸭坦布苏病毒(DTMUV)囊膜糖蛋白结构域3(ED3)蛋白作为免疫原,制备ED3蛋白的单克隆抗体并研究其中和活性。方法利用反转录PCR扩增DTMUV AH-F10株ED3基因,构建重组表达载体pET32a-ED3并转化至表达菌株Rosetta,诱导表达后... 详细信息

目的以纯化的重组鸭坦布苏病毒(DTMUV)囊膜糖蛋白结构域3(ED3)蛋白作为免疫原,制备ED3蛋白的单克隆抗体并研究其中和活性。方法利用反转录PCR扩增DTMUV AH-F10株ED3基因,构建重组表达载体pET32a-ED3并转化至表达菌株Rosetta,诱导表达后利用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。以纯化的目的蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠的脾细胞与Sp2/0细胞进行细胞融合,采取有限稀释法筛选杂交瘤细胞并大量制备单克隆抗体。利用Western blot法、间接免疫荧光法、ELISA及分型试剂盒对单克隆抗体进行鉴定并通过病毒中和试验检测抗体中和效价。结果成功表达DTMUV ED3蛋白,并制备3株ED3蛋白的鼠源单克隆抗体B9D10C7、B9D7B8G10、B9D7B8F11,其亚型分别为IgG1、IgG2a、IgG2b,腹水间接ELISA检测抗体效价均达到1∶51200,且能够识别DTMUV的E蛋白,具有一定的中和活性。结论获得3株特异性强、敏感性高的DTMUV ED3的单克隆抗体。

关键词：鸭坦布苏病毒(DTMUV) 囊膜糖蛋白结构域3(ED3) 原核表达单克隆抗体

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