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甲羟戊酸激酶基因真核及shRNA表达载体构建及其对BxPC-3细胞周期蛋白表达的影响

安徽医科大学学报 2016年第1期51卷 22-26页

作者：金锐王芳栾康罗欣张胜权安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室合肥230032

目的构建甲羟戊酸激酶（MVK）基因真核及shRNA表达载体并转染至BxPC-3细胞中,观察其对细胞周期蛋白的影响。方法从BxPC-3细胞中提取总RNA,逆转录PCR（RT-PCR）法获得目的基因MVK以及通过化学合成MVK（751~779）和MVK（1089~1117）位... 详细信息

目的构建甲羟戊酸激酶（MVK）基因真核及shRNA表达载体并转染至BxPC-3细胞中,观察其对细胞周期蛋白的影响。方法从BxPC-3细胞中提取总RNA,逆转录PCR（RT-PCR）法获得目的基因MVK以及通过化学合成MVK（751~779）和MVK（1089~1117）位点寡核苷酸片段,构建真核表达及shRNA表达载体并转染至BxPC-3细胞,筛选稳定表达细胞系。Westernblot法分析转染后对BxPC-3细胞周期蛋白的影响。结果成功获得MVK基因真核表达（pcD-NA3.1-mvk）及两个针对MVK shRNA表达载体（piLenti-RNAi-shRNA1/2）。通过抗生素筛选及Westernblot分析获得了稳定的MVK过表达及低表达细胞株。Westernblot分析显示：过表达MVK的细胞株及MVK knockdown的细胞株中细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinE表达量与正常及对照细胞相比均显著降低。结论 MVK过表达及低表达均抑制Bx-PC-3细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E的表达。

关键词：甲羟戊酸激酶基因重组寡核苷酸细胞周期蛋白 BxPC-3 shRNA

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TLR7激活上调细胞周期蛋白表达促进Hela细胞增殖

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安徽医科大学学报 2018年第2期53卷 167-170页

作者：刘莉李磊顾亚男周宏罗欣张胜权安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室合肥230032

目的探讨Toll样受体7(TLR7)信号通路激活对人宫颈癌Hela细胞周期蛋白表达及对细胞增殖的影响。方法使用不同浓度的Gardiquimod经过不同的时间刺激Hela细胞,采用MTS比色法分析其对Hela细胞增殖的影响;采用流式细胞仪检测同一浓度的TLR7... 详细信息

目的探讨Toll样受体7(TLR7)信号通路激活对人宫颈癌Hela细胞周期蛋白表达及对细胞增殖的影响。方法使用不同浓度的Gardiquimod经过不同的时间刺激Hela细胞,采用MTS比色法分析其对Hela细胞增殖的影响;采用流式细胞仪检测同一浓度的TLR7激动剂Gardiquimod经过不同的时间刺激Hela细胞后对Hela细胞周期的影响;Western blot分析Gardiquimod经过不同的时间刺激Hela细胞后对细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E表达水平的影响。结果 TLR7的激活促进Hela细胞增殖,并呈时间和浓度依赖性;Gardiquimod可时间依赖性增加细胞周期在S期的比例;Cyclin B1、Cyclin E的表达水平随着Gardiquimod作用时间的增加而增加。结论 TLR7激动剂Gardiquimod可能通过上调细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E表达水平,进而促进Hela细胞增殖。

关键词： TLR7 Hela细胞 Gardiquimod 细胞周期蛋白细胞增殖

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Gardiquimod对HepG2细胞中VEGF和TIMP1表达的影响

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安徽医科大学学报 2014年第5期49卷 561-564页

作者：程丰伟李磊王芳金锐罗欣张胜权安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室合肥230032

目的研究Toll样受体7(TLR7)的配体Gardiquimod对HepG2细胞中血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)mRNA表达的影响,并分析其激活的信号通路。方法 HepG2细胞经不同时间的Gardiquimod(2μg/ml)处理后,提取细胞总RNA和总... 详细信息

目的研究Toll样受体7(TLR7)的配体Gardiquimod对HepG2细胞中血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)mRNA表达的影响,并分析其激活的信号通路。方法 HepG2细胞经不同时间的Gardiquimod(2μg/ml)处理后,提取细胞总RNA和总蛋白,RT-PCR分析VEGF和TIMP1转录水平的变化;Western blot分析丝裂原蛋白激活激酶-胞外信号调节激酶(MAPKs-ERK1/2)信号通路,并通过MAPKs-ERK1/2特异性阻断剂PD98059阻断相应的信号途径,进而分析两者的相关性。结果 HepG2细胞中表达TLR7,但较外周血单个核细胞(PBMC)较少。Gardiquimod刺激HepG2 10 min后下调细胞中VEGF mRNA的表达,而刺激细胞30 min后TIMP1 mRNA的表达有明显的上调;Western blot结果显示,细胞中的ERK1/2的磷酸化水平明显降低;并且ERK1/2的特异性抑制剂(PD98059)能有效抑制HepG2细胞中ERK1/2磷酸化作用。结论 TLR7激活能够下调HepG2细胞中VEGF的表达,并与ERK1/2信号通路相关;同时TLR7激活上调TIMP1的表达,但与ERK1/2信号通路无相关性。

关键词： TLR7 VEGF TIMP1 HepG2 Gardiquimod

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人白细胞介素-31的真核表达及其对HaCaT细胞IL-6和TNFα表达的影响

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中国生化药物杂志 2011年第5期32卷 345-348页

作者：黄海良罗欣顾芳张胜权安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室安徽合肥230032

目的构建人白细胞介素-31(hIL-31)基因真核表达载体并将其转染到HaCaT细胞,观察其对HaCaT细胞炎症因子分泌的影响。方法分离人外周血单核细胞,加入终浓度为20 nmol/L的豆蔻佛波醇乙酯(PMA),继续培养24 h收集细胞。RT-PCR克隆hIL-31 cDNA... 详细信息

目的构建人白细胞介素-31(hIL-31)基因真核表达载体并将其转染到HaCaT细胞,观察其对HaCaT细胞炎症因子分泌的影响。方法分离人外周血单核细胞,加入终浓度为20 nmol/L的豆蔻佛波醇乙酯(PMA),继续培养24 h收集细胞。RT-PCR克隆hIL-31 cDNA,并将其克隆到真核表达载体pSecTag2/Hygro B上。将构建成功的重组体转染至HaCaT细胞,用Western blot分析hIL-31在细胞中的表达以及RT-PCR方法分析其对IL-6、TNFα表达的影响。结果经双酶切、测序及Blast分析鉴定,我们成功获得hIL-31基因cDNA全长序列和pSecTag2/HygroB-IL-31重组体。转染至HaCaT细胞的外源性hIL-31可以促进IL-6、TNFα的表达。结论 hIL-31可以通过自分泌的方式促进HaCaT细胞炎性相关细胞因子的表达。

关键词：人白介素-31 真核表达皮肤角质形成细胞

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口腔白斑组织癌变标志性基因筛查

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中国生物化学与分子生物学报 2011年第7期27卷 679-686页

作者：陈显久刘玮玮史培荣郝梅程牛亮牛勃解军山西医科大学生物化学与分子生物学教研室太原030001

口腔黏膜白斑病(oral leukoplakia,OLK)是最常见的口腔粘膜的癌前病变.OLK恶性转化率高达43%,因此加强其风险调查和监测对于该病的预防和治疗具有重要意义.本研究采用美国SuperArray公司的肿瘤基因芯片(OHS-802)检测口腔正常组织、OLK... 详细信息

口腔黏膜白斑病(oral leukoplakia,OLK)是最常见的口腔粘膜的癌前病变.OLK恶性转化率高达43%,因此加强其风险调查和监测对于该病的预防和治疗具有重要意义.本研究采用美国SuperArray公司的肿瘤基因芯片(OHS-802)检测口腔正常组织、OLK组织和口腔鳞状细胞癌(oralsquamous cell carcinoma,OSCC)组织的肿瘤相关基因表达差异,旨在筛查与口腔黏膜白斑病发生和癌变相关的表达阳性基因,为探究OLK的发生及癌变机制奠定基础.将"正常组织→OLK组织→OSCC组织"连续递增2倍以上或递减2倍以上的基因确定为OLK组织癌变的标志性基因.SuperArray基因芯片、RT-PCR法和实时定量PCR结果显示,仅有3个基因(ACP-2、BCL-2、SOCS-3)表达水平连续下调2倍以上,有6个基因(CLK-3、CTNNB-1、FKBP-8、GDF-15、NF-1、XRCC-1)表达连续上调2倍以上.进一步经RT-PCR和实时定量PCR验证,其结果与SuperArray结果一致.本研究结果提示,ACP-2等9个基因可能是口腔正常黏膜组织经OLK转变为癌组织的驱动基因,可作为OLK组织、OSCC组织和口腔正常黏膜组织诊断的分子标志.

关键词：口腔黏膜白斑病口腔鳞状细胞癌基因芯片基因表达

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siRNA表达载体对SW480细胞原癌基因Pokemon的抑制

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中国生物工程杂志 2009年第6期29卷 7-13页

作者：郭睿李喜霞解军山西医科大学生物化学与分子生物学教研室太原030001

观察siRNA表达载体对SW480细胞中Pokemon原癌基因的抑制效应,为进一步研究该基因的功能奠定基础。构建针对Pokemon基因的RNAi质粒表达载体,脂质体法转染人结直肠癌SW480细胞系,观察转染效率及细胞表型变化。稳定转染后,实时荧光定量PCR... 详细信息

观察siRNA表达载体对SW480细胞中Pokemon原癌基因的抑制效应,为进一步研究该基因的功能奠定基础。构建针对Pokemon基因的RNAi质粒表达载体,脂质体法转染人结直肠癌SW480细胞系,观察转染效率及细胞表型变化。稳定转染后,实时荧光定量PCR和Western blot检测SW480细胞中Pokemon mRNA及蛋白质的表达情况;MTT法检测siRNA对SW480细胞恶性增殖的影响;流式细胞仪分析细胞凋亡改变。镜下观察阳性转染率约36%,转染表达载体后细胞形态发生了显著变化;Pokemon mRNA及蛋白质的表达受到明显抑制:与阴性对照组相比,表达质粒产生的siRNA对Pokemon mRNA的抑制率在转染后24h和48h分别为34.2%和67.7%;对蛋白的抑制率在48h和72h分别为48.3%和73.6%。MTT法检测细胞生长曲线表明Pokemon抑制可使SW480细胞生长速度明显减慢;流式细胞仪分析显示转染Pokemon siRNA表达质粒后SW480细胞凋亡增加。构建的RNAi表达载体可以有效抑制SW480细胞中Pokemon基因的表达,并对SW480细胞的生长具有明显抑制及诱导凋亡作用。

关键词： RNA干扰 Pokemon SW480 基因表达

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Ang-(1-7)通过G蛋白偶联受体Mas在人肝癌细胞HepG2中的作用

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基因组学与应用生物学 2015年第6期34卷 1149-1154页

作者：汪建阳李建玲廖维芳吴正远林文珍广西医科大学生物化学与分子生物学教研室南宁530021

为了研究Ang-(1-7)通过Mas对人肝癌细胞增殖的影响及在Mas高、低表达模型中分析其表达差异、凋亡等细胞生理活性变化,我们采用药物(Mas激活剂Ang-(1-7),Mas抑制剂A779)干预Hep G2细胞,分别对Ang-(1-7)和A799进行剂量、时间效应实验,实... 详细信息

为了研究Ang-(1-7)通过Mas对人肝癌细胞增殖的影响及在Mas高、低表达模型中分析其表达差异、凋亡等细胞生理活性变化,我们采用药物(Mas激活剂Ang-(1-7),Mas抑制剂A779)干预Hep G2细胞,分别对Ang-(1-7)和A799进行剂量、时间效应实验,实时定量RT-PCR检测药物干预后细胞Mas的表达水平,最后流式细胞仪检测药物干预后细胞的凋亡变化。结果表明,Ang-(1-7)与A779的有效工作浓度为10-7mol/L,Ang-(1-7)促进Mas的表达,Mas表达水平高于对照组。相反,A779抑制Mas的表达,但作用不明显,主要为拮抗Ang-(1-7)的功能。Ang-(1-7)处理组细胞凋亡明显升高,揭示Mas表达提升诱导人肝癌细胞凋亡。

关键词： Mas HepG2细胞药物干预激活剂抑制剂细胞凋亡

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微型制备型电泳比较从细胞中提取蛋白质的3种方法

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实验室研究与探索 2017年第10期36卷 21-23,79页

作者：顾芳汪慎燚秦宜德安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室合肥230032

为探索建立适用于从人卵巢癌细胞株SKOV3中提取蛋白质的最优化方法,通过培养人卵巢癌细胞株SKOV3,分别采用Pull-Down Lysis、RIPA裂解法和加有硫脲的细胞裂解液提取细胞总蛋白,使用Bradford法测定蛋白质浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PA... 详细信息

为探索建立适用于从人卵巢癌细胞株SKOV3中提取蛋白质的最优化方法,通过培养人卵巢癌细胞株SKOV3,分别采用Pull-Down Lysis、RIPA裂解法和加有硫脲的细胞裂解液提取细胞总蛋白,使用Bradford法测定蛋白质浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,然后使用微型制备型电泳分离蛋白,根据色谱图上的吸收峰比较从人卵巢癌细胞株SKOV3细胞中提取蛋白质的3种方法。结果表明:不同方法提取人卵巢癌细胞株SKOV3总蛋白的丰度及色谱图存在差异,PullDown Lysis试剂法在分离相对分子质量为15~80 k Da的蛋白质方面具有明显的优势。3种方法中以Pull-Down Lysis试剂法为人卵巢癌细胞株SKOV3蛋白质提取的最优方法,与微型制备型电泳的兼容性更好。

关键词：蛋白质提取 SKOV3细胞制备型电泳优化方法

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人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

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中国生化药物杂志 2011年第3期32卷 187-190页

作者：陶千山罗欣柴瑜胡道军张胜权安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室安徽合肥230032

目的克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体。方法通过PCR方法从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5′上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报... 详细信息

目的克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体。方法通过PCR方法从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5′上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Basic载体上,构建IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含最长启动子序列的报告基因载体转染至HaCaT细胞,并设置空白对照组和LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果经PCR方法扩增出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆最长序列具有启动子活性。结论成功构建了IL-15系列启动子报告基因载体,并在HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL-15表达调控机制奠定了实验基础。

关键词： IL-15 启动子双荧光素酶报告基因

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Aurora-A基因过表达与消化道肿瘤临床病理特征相关性Meta分析

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中华肿瘤防治杂志 2016年第5期23卷 341-346页

作者：贺春李朝慧邓青任本洪王晓霞山西医科大学生物化学与分子生物学教研室山西太原030001

目的Aurora-A在消化道肿瘤组织中存在过表达，本研究通过Meta分析的方法综合评价Aurora-A基因过表达与消化道肿瘤患者临床病理特征的相关性，为消化道肿瘤的诊断和治疗寻求新的靶点。方法计算机检索PubMed、Cochrane、Highwire Press、... 详细信息

目的Aurora-A在消化道肿瘤组织中存在过表达，本研究通过Meta分析的方法综合评价Aurora-A基因过表达与消化道肿瘤患者临床病理特征的相关性，为消化道肿瘤的诊断和治疗寻求新的靶点。方法计算机检索PubMed、Cochrane、Highwire Press、中国知网（CNKI）、维普中文科技期刊全文数据库（VIP）、万方和中国生物医学文献数据库（CBM）等，检索时间均为建库至2015—08—01。通过设置的纳入与排出标准筛选研究文献并提取资料，根据Newcastle-Ottowa Scale（NOS）评价纳入资料的质量，采用Review Manager5．2软件进行系统分析。结果符合条件的13篇（其中食管癌4篇，胃癌5篇，肠癌4篇）文献中样本量合计1973例。Aurora-A蛋白表达与肿瘤浸润深度Meta分析共纳入9篇文献，样本量711例，Aurora-A在浅层浸润组（T1～T2）和深层浸润组（T3～T4）表达差异有统计学意义，OR=2．90，95％CI为2．09～4．04，P〈0．001；Aurora-A蛋白表达与淋巴结转移Meta分析共纳入8篇文献，样本量758例，Aurora—A在淋巴结转移组和无淋巴结转移组表达差异有统计学意义，OR=1．47，95％CI为1．07～2．01，P=0．02；但Aurora-A过表达与肿瘤分化程度及临床分期无相关性。结论Aurora—A基因过表达可以促进消化道肿瘤的侵袭和转移，与消化道肿瘤的恶性程度呈正相关，将这为消化道肿瘤的早期诊断、预后分析及靶向治疗提供重要的参考价值。

关键词： Aurora-A 消化道肿瘤 Meta分析

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