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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2013年第2期31卷 95-98页

作者：焦玉萌方强夏惠王雪梅陶志勇陈兴智沈继龙蚌埠医学院病原生物学教研室安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠233030 安徽医科大学病原生物学教研室合肥230032

目的观察弓形虫排泄分泌抗原(TgESA)对B16F10黑色素瘤接种小鼠CD8+T细胞的影响,以及CD8+T细胞对B16F10黑色素瘤的作用。方法取RH株弓形虫速殖子体外培养12 h后,收集培养液,离心取上清,获得弓形虫ESA。15只C57BL/6小鼠随机分为A、B和C三... 详细信息

目的观察弓形虫排泄分泌抗原(TgESA)对B16F10黑色素瘤接种小鼠CD8+T细胞的影响,以及CD8+T细胞对B16F10黑色素瘤的作用。方法取RH株弓形虫速殖子体外培养12 h后,收集培养液,离心取上清,获得弓形虫ESA。15只C57BL/6小鼠随机分为A、B和C三组(每组5只)。B组和C组每鼠右腋窝皮下接种B16F10黑色素瘤细胞2×105个,A组注射等量无菌PBS。接种后第7天,C组每只小鼠腹腔注射TgESA 100μl。接种后第13天,处死小鼠,无菌取脾。流式细胞仪检测各组小鼠CD3+CD8+T细胞所占脾细胞比例;采用免疫磁珠分选B组和C组脾细胞中的CD8+T细胞,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测两组CD8+T细胞对B16F10细胞的杀伤作用,分别设效靶细胞比为2.5∶1、5∶1和10∶1。另取30只C57BL/6小鼠随机分为E、F和G三组(每组10只),每鼠接种B16F10细胞2×105个。接种同时,F组和G组小鼠分别尾静脉注射分离自B组和C组的CD8+T细胞(2×105个/鼠)。观察小鼠瘤体生长情况,记录各组小鼠死亡数和死亡时间,共观察35 d。结果流式细胞仪检测结果显示,A、B和C组脾脏CD3+CD8+T细胞占脾细胞的比例分别为(13.86±0.13)%、(14.18±0.27)%和(15.74±0.28)%,C组显著高于其他两组(P<0.05)。LDH释放试验结果显示,不同效靶细胞比时,C组的CD8+T细胞杀伤活性均显著高于B组(均P<0.05)。G组的平均出瘤时间[(14.9±1.2)d]晚于F组[(11.9±0.7)d]和E组[(9.4±1.2)d](P<0.05)。3组小鼠自出瘤后瘤体均不断增长,但增长速度无明显差异,G组的瘤体面积始终小于其他两组(均P<0.05)。E、F和G组小鼠分别于B16F10细胞接种后第26、29和30天开始出现死亡,至观察终点(第35天),3组小鼠存活的数量分别为3、5和7只。结论TgESA可上调B16F10黑色素瘤小鼠CD8+T细胞的数量和杀伤功能,上调的CD8+T细胞具有早期延缓肿瘤生长的作用。

关键词：刚地弓形虫排泄分泌抗原 CD8+ T细胞黑色素瘤

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某医院2012-2013年242株肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶及整合子耐药基因检测

某医院2012-2013年242株肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶及整合子耐药基...

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纪念中国微生物学会临床微生物学专业委员会成立五周年-第五届中国临床微生物学大会暨台湾海峡两岸微生物学与免疫学论坛

作者：郭普贺晓珊梅传忠李兴武刘双成沈继龙蚌埠医学院第一附属医院检验科蚌埠医学院医学检验系安徽病原生物学省级实验室和人兽共患病安徽省重点实验室安徽医科大学病原学教研室

目的了解肺炎克雷伯菌主要的β-内酰胺酶和整合子耐药基因型,明确其耐药特性。方法回顾性分析我院2012年1月至2013年5月临床分离的242株肺炎克雷伯菌药敏结果,聚合酶链反应(PCR)检测其β-内酰胺酶及整合子耐药基因。结果242株肺炎克雷... 详细信息

目的了解肺炎克雷伯菌主要的β-内酰胺酶和整合子耐药基因型,明确其耐药特性。方法回顾性分析我院2012年1月至2013年5月临床分离的242株肺炎克雷伯菌药敏结果,聚合酶链反应(PCR)检测其β-内酰胺酶及整合子耐药基因。结果242株肺炎克雷伯菌对16种抗生素存在不同程度的耐药,其中氨曲南、头孢唑啉、氨苄西林/舒巴坦、头孢曲松和头孢他啶耐药率较高,分别为76.86%、65.70%、63.64%、62.40%和59.92%;亚胺培南、丁胺卡那、厄他培南和哌拉西林/他唑巴坦较为敏感,分别为17.77%、18.88%、18.88%和23.55%。PCR结果显示,ESBLs基因阳性155株,占64.05%,主要为TEM型和SHV型,两者均存在的菌株有114株,占产ESBLs基因菌株的73.55%(114/155)。其次为KPC基因86株,占35.54%;此外AmpC基因43株,占17.77%,全部为DHA型。整合子基因128株,占52.89%,以整合子1(intI-1)为主,共检出120株,占49.59%。结论我院肺炎克雷伯菌耐药情况严重,主要的耐药基因型为TEM型、SHV型、KPC和intI-1。

关键词：肺炎克雷伯菌耐药基因聚合酶链反应(PCR)

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三种免疫调节剂增强弓形虫重组ROP2疫苗保护效应的研究

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中国人兽共患病学报 2013年第6期29卷 570-574页

作者：陈兴智杨小迪杨雯陈勇刘丽丽沈继龙孙新蚌埠医学院病原生物学教研室安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠233030 安徽病原生物学省级实验室人兽共患病安徽省重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室合肥230032

目的观察弗氏佐剂(Freund’s Adjuvant,FA)、匹多莫德(Pidotimod,PT)和西咪替丁(Cimetidine,CIM)等3种免疫调节剂增强重组弓形虫棒状体蛋白2(rROP2)疫苗的免疫保护效应。方法将100只BALB/c小鼠随机分为PBS对照组、重组rROP2疫苗组、FA-r... 详细信息

目的观察弗氏佐剂(Freund’s Adjuvant,FA)、匹多莫德(Pidotimod,PT)和西咪替丁(Cimetidine,CIM)等3种免疫调节剂增强重组弓形虫棒状体蛋白2(rROP2)疫苗的免疫保护效应。方法将100只BALB/c小鼠随机分为PBS对照组、重组rROP2疫苗组、FA-rROP2疫苗组、PT-rROP2疫苗组和CIM-rROP2疫苗组等5组;FA、PT和CIM分别与rROP2抗原混合皮下注射免疫,检测小鼠细胞免疫和体液免疫指标,并观察弓形虫RH株攻击感染后的生存时间。结果 FA-rROP2组、CIM-rROP2组小鼠血清IFN-γ、特异性IgG、脾细胞增殖活性及外周血CD4+/CD8+比值均显著高于rROP2蛋白组(P<0.05);PT对外周血CD4+/CD8+比值无明显影响,但显著增加了IFN-γ的水平及脾细胞增殖活性。小鼠攻击试验表明,FA-rROP2组、PT-rROP2组以及CIM-rROP2组小鼠存活时间显著长于rROP2组和PBS对照组组;rROP2蛋白组各项指标均显著高于PBS组(P<0.05)。结论 FA、PT和CIM可增强rROP2蛋白抗原诱导的细胞免疫和体液免疫反应,都能延长攻击感染小鼠的生存时间,具有增强rROP2蛋白疫苗保护效应的功能。其中CIM的佐剂样免疫促进作用接近于FA,但副作用显著低于后者,具有临床实用的潜在价值。

关键词：弓形虫弗氏佐剂匹多莫德西咪替丁 ROP2蛋白免疫佐剂

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刚地弓形虫基因型和与基因型相关的致病机制研究进展

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2013年第4期31卷 319-324页

作者：王林沈继龙安徽中医药大学第一附属医院检验中心合肥230031 安徽医科大学病原生物学教研室合肥230032 安徽病原生物学省级实验室人兽共患病安徽省重点实验室合肥230032

弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的呈世界性分布的人兽共患寄生虫病,对人类健康和畜牧业发展造成严重危害。弓形虫属仅有刚地弓形虫一种,经多重酶切电泳分析(MLEE),PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和微卫星分型... 详细信息

弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的呈世界性分布的人兽共患寄生虫病,对人类健康和畜牧业发展造成严重危害。弓形虫属仅有刚地弓形虫一种,经多重酶切电泳分析(MLEE),PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和微卫星分型等研究发现,各地刚地弓形虫具有丰富的遗传多态性。已知不同基因型弓形虫株的致病机制不同。本文对世界各地区弓形虫株基因型及基因型与毒力间的相关性研究进展进行了综述。

关键词：刚地弓形虫基因型种群结构毒力

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间日疟原虫安徽地域株乳酸脱氢酶基因序列同源性分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2013年第2期31卷 148-150页

作者：胡明洁方强吴守伟汤必奎张静焦玉萌夏惠沈继龙蚌埠医学院遗传学教研室蚌埠233030 蚌埠医学院病原生物学教研室安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠233030 安徽医科大学病原生物学教研室合肥230032

采集安徽省蚌埠市区、五河县、怀远县、蒙城县和利辛县2009-2010年的39例间日疟患者血样,分别提取DNA,PCR扩增间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)基因,并克隆测序,以及Blast序列分析。结果显示,克隆的PvLDH基因片段为951 bp。序列分析发现,采... 详细信息

采集安徽省蚌埠市区、五河县、怀远县、蒙城县和利辛县2009-2010年的39例间日疟患者血样,分别提取DNA,PCR扩增间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)基因,并克隆测序,以及Blast序列分析。结果显示,克隆的PvLDH基因片段为951 bp。序列分析发现,采自安徽地区的39例间日疟患者血样的PvLDH基因序列之间无差异(登录号为GU078391),与GenBank中其他地域株的PvLDH基因序列同源性均>99%,氨基酸序列仅分别与EJEU60134株和MIA061251株存在1个氨基酸的差异。

关键词：间日疟原虫乳酸脱氢酶同源性分析

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酵母双杂交筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2013年第1期31卷 18-22页

作者：都建安然程里陈滢沈继龙安徽医科大学基础医学院生化与分子生物学教研室合肥230032 安徽医科大学药学院合肥230032 安徽医科大学省部级基因研究重点实验室病原生物学教研室合肥230032

目的利用酵母双杂交方法,筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白。方法 RT-PCR扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因片段,扩增产物经双酶切后插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母AH109菌株中,检测诱饵载体有无毒性和自... 详细信息

目的利用酵母双杂交方法,筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白。方法 RT-PCR扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因片段,扩增产物经双酶切后插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母AH109菌株中,检测诱饵载体有无毒性和自激活作用,利用酵母双杂交系统从人胚胎脑cDNA文库中筛选与ROP18相互作用的宿主蛋白。结果构建了诱饵载体pGBKT7-ROP18,ROP18具有自激活功能。用ROP18^(25-25lan)为诱饵,筛选获得一系列与ROP18相互作用的宿主蛋白:DNA损伤特异性结合蛋白1(DDB1)、torsin A相互作用蛋白1(TOR1AIP1)、整联蛋白β1(integrinβ1)、溶质运载蛋白3(SLC3A2)、酪氨酸硫化转移酶2(TPST2)、Derl样域家族成员2(DERL2)和OCIA结构域蛋白1(OCIAD1)。结论通过酵母双杂交技术筛选出与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的多种宿主蛋白。

关键词：弓形虫 ROP18^25-251aa 酵母双杂交相互作用宿主蛋白

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姜黄素对弓形虫感染小胶质细胞NO的产生及iNOS表达的影响

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中国人兽共患病学报 2013年第4期29卷 375-379页

作者：王璐张义华孔兰婷王为为张倩罗庆礼沈继龙沙泉安徽医科大学免疫学教研室及过敏与免疫研究中心合肥230032 安徽省病原生物学实验室及安徽省人兽共患病重点实验室合肥230032

目的研究姜黄素(curcumin)对弓形虫PRU虫株(type II基因型)感染的BV-2细胞一氧化氮(NO)的产生及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达的影响。方法用弓形虫PRU虫株(5×105)感染BV-2细胞,同时用姜黄素进行... 详细信息

目的研究姜黄素(curcumin)对弓形虫PRU虫株(type II基因型)感染的BV-2细胞一氧化氮(NO)的产生及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达的影响。方法用弓形虫PRU虫株(5×105)感染BV-2细胞,同时用姜黄素进行干预,观察细胞形态;MTT检测细胞增殖;用Griess法检测细胞上清中NO的含量;Western blotting检测iNOS蛋白的表达。结果与对照组相比,感染弓形虫的小胶质细胞胞体变圆,突起减少,姜黄素可以减轻这种改变。弓形虫感染的小胶质细胞iNOS的表达增强,NO释放量增加,且随着时间延长逐渐增高,姜黄素能抑制iNOS的表达和NO的产生。结论姜黄素可以抑制弓形虫感染的BV-2细胞iNOS蛋白表达和NO的产生,提示该药对弓形虫脑病具有潜在的治疗价值。

关键词：神经小胶质细胞姜黄素弓形虫一氧化氮

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二(喹唑啉-4-基)二硒醚体外抗弓形虫速殖子的实验研究

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中国人兽共患病学报 2013年第7期29卷 692-696页

作者：陈兴智杨雯杨小迪王旗夏惠刘刚沈继龙蚌埠医学院病原生物学教研室安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠233030 鲁东大学化学与材料科学学院烟台264025 人兽共患病安徽省重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室合肥230032

目的观察二(喹唑啉-4-基)二硒醚体外对弓形虫RH株速殖子杀伤作用,探讨该药抗弓形虫的效果与机制。方法将二(喹唑啉-4-基)二硒醚,(下称药物)浓度分为4组,即生理盐水对照组(A组)、药物浓度为0.05μg/mL(B组)、0.5μg/mL(C组)、5.00μg/mL(... 详细信息

目的观察二(喹唑啉-4-基)二硒醚体外对弓形虫RH株速殖子杀伤作用,探讨该药抗弓形虫的效果与机制。方法将二(喹唑啉-4-基)二硒醚,(下称药物)浓度分为4组,即生理盐水对照组(A组)、药物浓度为0.05μg/mL(B组)、0.5μg/mL(C组)、5.00μg/mL(D组),分别加入到含弓形虫速殖子(含虫体4×106个/mL)的24孔培养板中,于1h、2h、4h后收集弓形虫速殖子,以Trypan blue染色法检测弓形虫着色率;C组和A组以MTT法检测弓形虫活性,Giemsa染色法观察虫体形态和结构变化,透射电镜观察弓形虫速殖子超微结构。结果不同浓度(0.05μg/mL、0.5μg/mL、5.00μg/mL)弓形虫经二(喹唑啉-4-基)二硒醚作用1h后的着色率分别为5.00%、26.70%和99.50%,作用2h后的着色率分别为22.00%、98.70%和100.00%,作用4h后的着色率分别为58.30%、100.00%和100.00%;生理盐水组1h、2h、4h后的着色率分别为1.0%、1.20%和1.70%。0.5μg/mL浓度药物组,MTT检测弓形虫活性,OD值随时间延长增长率明显低于生理盐水对照组(P<0.05);Giemsa染色观察,弓形虫速殖子随着时间的延长,逐渐出现肿胀,两端变圆,虫体坏死现象;透射电镜观察随着时间延长,逐渐出现虫体肿胀,胞膜与基质之间空隙明显,越来越多和大的空泡形成,胞膜出现断裂,内部结构溶解模糊。结论二(喹唑啉-4-基)二硒醚体外可部分或全部杀死弓形虫,效果与时间、剂量相关。

关键词：二(喹唑啉-4-基)二硒醚刚地弓形虫速殖子体外

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钠离子通道Na_v1.7在大鼠牙髓炎中的表达

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安徽医科大学学报 2013年第8期48卷 873-877页

作者：祝心威蒋勇沈继龙罗庆礼李炯陶然许乐朱凌安徽医科大学口腔医学院安徽医科大学附属口腔医院安徽省口腔疾病研究中心实验室合肥230032 安徽病原生物学省级实验室和人兽共患病安徽省重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室合肥230032 安徽医科大学第四附属医院口腔科合肥230022

目的通过检测大鼠实验性牙髓炎牙髓中电压门控钠离子通道Nav1.7的表达,探讨Nav1.7的表达与牙痛的关系。方法大鼠切牙髓腔暴露,置入脂多糖(LPS)诱导产生牙髓炎。大鼠分为正常对照组和封LPS 1、3、5 d组,HE染色观察各组牙髓组织病理学改... 详细信息

目的通过检测大鼠实验性牙髓炎牙髓中电压门控钠离子通道Nav1.7的表达,探讨Nav1.7的表达与牙痛的关系。方法大鼠切牙髓腔暴露,置入脂多糖(LPS)诱导产生牙髓炎。大鼠分为正常对照组和封LPS 1、3、5 d组,HE染色观察各组牙髓组织病理学改变。通过免疫组化、ELISA和逆转录PCR(RT-PCR)方法检测大鼠正常牙髓和炎症牙髓中Nav1.7的表达。结果封LPS 1 d组,牙髓中未见明显炎症,而封LPS 3和5 d组牙髓中炎症反应程度逐渐上升。免疫组化结果显示,Nav1.7在所有牙髓中均有表达,封LPS 3和5 d组牙髓中Nav1.7表达量较正常对照组明显增加(P<0.05);ELISA结果与上述结果相似。RT-PCR结果显示,封LPS 3和5 d组牙髓中Nav1.7 mRNA较正常对照组有显著上调(P<0.05)。结论在牙髓炎中,Nav1.7可能以时序控制方式表达明显增多,且与牙髓炎炎症程度相关。鉴于Nav1.7在疼痛中发挥了重要作用,牙髓中Nav1.7的表达可能涉及牙痛的病理生理机制。

关键词：电压门控钠离子通道牙髓炎症 Nav 1 7

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日本血吸虫亮氨酸氨基肽酶的原核表达及纯化

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中国生物制品学杂志 2013年第2期26卷 196-199页

作者：钟政荣徐云侠宫继勇田万林郭普李小月罗庆礼沈继龙安徽省蚌埠医学院第一附属医院安徽蚌埠233004 安徽医科大学病原生物学教研室安徽合肥230021

目的原核表达并纯化日本血吸虫亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase of Schistosoma japonicum,SjLAP)。方法从日本血吸虫成虫中RT-PCR扩增LAP基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,转化感受态*** BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组SjLAP蛋白(rSjLAP)经SDS-PAGE和Western blot分析后,经His Binding Purification Kit层析纯化,纯化的rSjLAP蛋白经SDS-PAGE分析纯度,Bradford法测定浓度。结果克隆的SjLAP基因与GenBank中登录的基因序列比较有2个碱基发生置换,导致对应的2个氨基酸发生置换,但均不在关键区域;重组表达质粒pET-28a/SjLAP经双酶切鉴定证实构建正确;表达的rSjLAP蛋白相对分子质量约45 000,诱导4 h表达量最高;纯化的rSjLAP蛋白纯度较高,浓度达5.0 mg/ml,并可被抗小鼠His-tag单抗及血吸虫感染的患者血清和兔血清特异性识别,具有良好的反应原性。结论成功在大肠杆菌中表达了rSjLAP蛋白,纯化的rSjLAP纯度较高,为血吸虫病的诊断和预防等研究奠定了基础。

关键词：血吸虫,日本亮氨酸氨基肽酶原核细胞基因表达诊断

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