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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第12期27卷 1155-1159页

作者：余轶婧沈继龙安徽医科大学教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室安徽省人兽共患病重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室合肥230032

近年来，与发展中国家相比，超敏反应性疾病与自身免疫性疾病的发病率在发达国家较高，并有上升趋势。随着卫生假说（hygiene hypothesis）的提出，许多学者进行了相关研究来试图解释这个假说。一些学者在研究血吸虫感染与超敏反应性疾... 详细信息

近年来，与发展中国家相比，超敏反应性疾病与自身免疫性疾病的发病率在发达国家较高，并有上升趋势。随着卫生假说（hygiene hypothesis）的提出，许多学者进行了相关研究来试图解释这个假说。一些学者在研究血吸虫感染与超敏反应性疾病及自身免疫性疾病的关系时发现了相关机制，并促使了对该假说的进一步研究。

关键词：自身免疫性疾病血吸虫感染调控作用超敏反应性疾病超敏性卫生假说发展中国家发达国家

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重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和鉴定

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中国生物制品学杂志 2007年第6期20卷 454-456页

作者：钟政荣沈继龙胡元生李小月罗庆礼蚌埠医学院第一附属医院检验科蚌埠233004 安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室合肥230032

目的观察两次切胶、两次电洗脱的方法纯化重组日本血吸虫14-3-3(Sj14-3-3)蛋白的效果。方法采用两次切胶、两次电洗脱的方法(与经典的切胶、电洗脱有所不同),纯化Sj14-3-3蛋白,并与柱层析纯化方法进行比较。结果采用两次切胶、两次电洗... 详细信息

目的观察两次切胶、两次电洗脱的方法纯化重组日本血吸虫14-3-3(Sj14-3-3)蛋白的效果。方法采用两次切胶、两次电洗脱的方法(与经典的切胶、电洗脱有所不同),纯化Sj14-3-3蛋白,并与柱层析纯化方法进行比较。结果采用两次切胶、两次电洗脱方法纯化的目的蛋白条带单一,浓度达3mg/ml,而柱层析法纯化的蛋白浓度仅为1mg/ml。Western blot证实纯化目的蛋白的特异性。结论两次切胶、两次电洗脱法可获得高纯度、高特异性的目的蛋白,不失为一种经济有效的蛋白纯化方法。

关键词：血吸虫 14-3-3蛋白纯化鉴定

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日本血吸虫信号蛋白14-3-3在毕赤酵母菌中的分泌表达及其抗原性分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2007年第1期25卷 12-16页

作者：郑美娟李敏王志成罗飞罗庆礼储德勇李丛磊沈继龙蚌埠医学院生物化学与分子生物学实验室蚌埠233003 安徽医科大学病原生物学教研室教育部与安徽省共建重要遗传病基因资源利用重点实验室(安徽医科大学) 合肥230032

目的在毕赤酵母菌(Pichia pastoris)表达系统中表达日本血吸虫信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3),并与原核表达rSj14-3-3比较其抗原性。方法以重组质粒pET28a-rSj14-3-3为模板,PCR扩增Sj14-3-3基因,将特异片段连接到pMD18-T载体,DNA序列分析后,... 详细信息

目的在毕赤酵母菌(Pichia pastoris)表达系统中表达日本血吸虫信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3),并与原核表达rSj14-3-3比较其抗原性。方法以重组质粒pET28a-rSj14-3-3为模板,PCR扩增Sj14-3-3基因,将特异片段连接到pMD18-T载体,DNA序列分析后,亚克隆目的片段Sj14-3-3至酵母菌分泌表达载体pPICZαB。测序正确后,重组质粒经电转化转染至毕赤酵母菌X-33菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取诱导上清进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)分析。用间接ELISA法比较毕赤酵母菌表达的rSj14-3-3和原核表达rSj14-3-3检测血吸虫病患者血清抗体的特异性和敏感性。结果目的基因已在酵母菌基因组中得到整合,PCR扩增得到约1 300 bp的片段。经甲醇诱导,Sj14-3-3表达并分泌到培养上清中。表达产物经SDS-PAGE测定为Mr 35 000。Western blotting结果显示,Mr 35 000蛋白可被Sj14-3-3单克隆抗体识别,表明该真核表达产物具有免疫反应性。间接ELISA检测结果表明,该重组蛋白检测36份急性血吸虫病患者血清rSj14-3-3抗体,阳性率为81%。与12份华支睪吸虫感染者血清未见交叉反应,32份健康人血清假阳性反应率为9.3%。以原核表达的rSj14-3-3为抗原,间接ELISA检测,36份急性血吸虫病患者血清的rSj14-3-3,抗体阳性率为88.9%;与12份华支睪吸虫感染者的交叉反应率为16.7%,32份健康人血清假阳性反应率为12.5%,其差异均无统计学意义(P>0.05)。结论在毕赤酵母菌中成功表达了Sj14-3-3,培养上清中产物丰度较高,且免疫反应性良好。

关键词：日本血吸虫信号蛋白14-3-3 毕赤酵母菌真核表达

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人巨噬细胞金属弹力酶催化域基因的克隆及表达

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安徽医科大学学报 2007年第3期42卷 269-271页

作者：鲍德明胡乃中沈际佳石海许建明安徽医科大学第一附属医院消化内科安徽省高校消化疾病重点实验室合肥230022 安徽医科大学病原生物学教研室合肥230032

目的克隆人巨噬细胞金属弹力酶催化域(HMEcd)基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌中表达HMEcd基因融合蛋白。方法用RT-PCR方法提取人胃癌组织总RNA并扩增出HMEcd cDNA,克隆入pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-HM Ecd,双酶切鉴定及DNA测序... 详细信息

目的克隆人巨噬细胞金属弹力酶催化域(HMEcd)基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌中表达HMEcd基因融合蛋白。方法用RT-PCR方法提取人胃癌组织总RNA并扩增出HMEcd cDNA,克隆入pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-HM Ecd,双酶切鉴定及DNA测序正确后再将HMEcd cDNA亚克隆至pET-28a(+)载体,构建原核表达载体pET-28a(+)-HM Ecd,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,并行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果RT-PCR获得预期的HMEcd cDNA,双酶切鉴定及DNA测序证实将HM Ecd基因分别正确插入克隆载体和原核表达载体中,SDS-PAGE及Western blotting鉴定证实表达出HMEcd融合蛋白。结论成功表达出HMEcd基因融合蛋白,为进一步功能实验研究奠定基础。

关键词：基质金属蛋白酶类基因表达克隆,分子

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日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶在虫卵阶段的定位

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安徽医科大学学报 2007年第1期42卷 1-4页

作者：王志成徐元宏汪学龙李敏罗飞郑美娟罗庆礼沈继龙安徽医科大学病原生物学教研室教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室和安徽省重要遗传病基因资源利用重点实验室合肥230032 安徽医科大学第一附属医院检验科合肥230022

目的探讨谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)在虫卵阶段的表达、定位和重组蛋白(rSj26GST)的免疫诊断价值。方法从感染日本血吸虫尾蚴6周的兔肝脏中分离虫卵,分别用RT-PCR和免疫印迹(Western blotting)法检测Sj26GST基因在虫卵阶段的转录和翻译... 详细信息

目的探讨谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)在虫卵阶段的表达、定位和重组蛋白(rSj26GST)的免疫诊断价值。方法从感染日本血吸虫尾蚴6周的兔肝脏中分离虫卵,分别用RT-PCR和免疫印迹(Western blotting)法检测Sj26GST基因在虫卵阶段的转录和翻译;同时用兔肝做免疫组化观察Sj26GST在虫卵内的分布。利用纯化的rSj26GST和日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA),采用间接ELISA法检测急、慢性血吸虫病患者和正常人血清。结果RT-PCR从血吸虫虫卵中扩增670bp的基因片断,Western blotting证明在虫卵阶段Sj26GST的表达;同时免疫组化显示Sj26GST主要分布在虫卵内毛蚴两边的侧腺。rSj26GST检测急、慢性血吸虫病患者和正常人血清的阳性率分别为92%、80%和0;用SEA检测以上标本,阳性率分别为96%、84%和2%。结论Sj26GST是SEA的主要组分之一,能刺激机体产生高滴度的抗体;rSj26GST为抗原诊断日本血吸虫病显示出高度的敏感性和特异性,具有实用价值。

关键词：血吸虫日本血吸虫病/诊断寄生虫虫卵计数

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循环抗原及血清抗体的联合检测诊断日本血吸虫病

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安徽医科大学学报 2007年第4期42卷 351-354页

作者：余轶婧沈继龙罗庆礼乔增培安徽医科大学病原生物学教研室教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室(省部共建)省重要遗传病基因资源利用重点实验室安徽医科大学人兽共患病研究所合肥230032

目的探讨日本血吸虫信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3)在血吸虫病免疫诊断中的价值。方法制备并纯化抗重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)的单抗和多抗,并建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA);以纯化的rSj14-3-3建立间接ELISA,分别比... 详细信息

目的探讨日本血吸虫信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3)在血吸虫病免疫诊断中的价值。方法制备并纯化抗重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)的单抗和多抗,并建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA);以纯化的rSj14-3-3建立间接ELISA,分别比较该两种方法以及两种方法联合检测对于急、慢性血吸虫病患者免疫诊断的特异性和敏感性。结果利用双抗体夹心ELISA、间接ELISA和联合检测3种方法检测急性患者血清70例,敏感性分别为72.9%、75.7%和91.4%;检测慢性患者血清110例,敏感性分别为46.4%、61.8%和82.7%;检测正常人血清100例,特异性分别为96%、92%和92%;吡喹酮治疗后患者血清161份,其中急性治疗后1年以内转阴率分别为50%、38.9%和33.3%;慢性治疗后1年内分别是76.4%、55.6%和43.1%;慢性治疗后2年以上分别为93.0%、83.0%和78.9%。3种方法检测华支睾吸虫病、钩虫病的交叉反应性分别为0%、15.6%和15.6%,8.7%、19.6%和21.7%。3种方法的敏感性、与华支睾吸虫感染者血清交叉反应、慢性治疗1年内及慢性治疗2年以上患者血清的转阴率差异具有显著性(P<0.05),而特异性、与钩虫感染者血清交叉反应及其他化疗后患者血清的转阴率差异无显著性(P>0.05)。结论循环抗原Sj14-3-3和抗体联合检测在日本血吸虫病免疫诊断中具有潜在的临床应用价值。

关键词：血吸虫病,日本/诊断 14-3-3蛋白质类抗原,蠕虫/分析抗体,蠕虫/分析

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联合检测血清抗日本血吸虫IgM和IgG4抗体意义的探讨

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热带病与寄生虫学 2007年第3期5卷 155-156+176页

作者：蒋斌罗庆礼沈继龙教育部重要遗传病共同资源利用重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室人兽共患病安徽省重点实验室

目的探讨联合检测血清特异性IgM和IgG4对日本血吸虫病的诊断价值。方法采用间接ELISA法检测急性血吸虫病、慢性血吸虫病及慢性血吸虫病患者治疗12月、24月后特异性IgM和IgG4的抗体变化。结果急性血吸虫病患者特异性IgM和IgG4阳性率分别... 详细信息

目的探讨联合检测血清特异性IgM和IgG4对日本血吸虫病的诊断价值。方法采用间接ELISA法检测急性血吸虫病、慢性血吸虫病及慢性血吸虫病患者治疗12月、24月后特异性IgM和IgG4的抗体变化。结果急性血吸虫病患者特异性IgM和IgG4阳性率分别是100%、87.9%,慢性血吸虫病患者特异性IgM和IgG4阳性率分别是45.5%、68.2%,联合检测急性血吸虫病和慢性血吸虫病患者特异性IgM和IgG4阳性率分别是100%和75.8%,慢性血吸虫病患者治疗12月、24月后特异性IgG4阳性率分别是16%、5%。结论并联检测特异性IgM和IgG4对急性血吸虫病早期诊断及慢性血吸虫病疗效考核具有较好的应用价值。

关键词：日本血吸虫间接ELISA法急性血吸虫病慢性血吸虫病早期诊断疗效考核

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GST-颗粒溶解素融合蛋白的纯化及其抗菌活性分析

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蚌埠医学院学报 2007年第3期32卷 265-267页

作者：闵宏林沈继龙陈勇李柏青安徽医科大学病原生物学教研室蚌埠医学院免疫学教研室安徽省感染与免疫重点实验室(蚌埠医学院) 安徽蚌埠233030

目的:纯化大肠埃希菌表达的GST-颗粒溶解素融合蛋白,并分析其体外抗菌活性。方法:将IPTG诱导处理后的细菌破碎,分离含有可溶性GST-颗粒溶解素融合蛋白的细菌裂解液,并通过GSH-琼脂糖珠亲和层析柱纯化。同时采用MTT法分析该纯化蛋白的抗... 详细信息

目的:纯化大肠埃希菌表达的GST-颗粒溶解素融合蛋白,并分析其体外抗菌活性。方法:将IPTG诱导处理后的细菌破碎,分离含有可溶性GST-颗粒溶解素融合蛋白的细菌裂解液,并通过GSH-琼脂糖珠亲和层析柱纯化。同时采用MTT法分析该纯化蛋白的抗菌活性。结果:GST-颗粒溶解素融合蛋白能以可溶性形式在大肠埃希菌中表达,采用亲和层析法可获得分子量为44kDa的单一蛋白条带。经抗菌活性分析,表明纯化产物对金黄色葡萄球菌和甲型溶血性链球菌具有显著抑制作用,而对伤寒沙门菌和大肠埃希菌BL21的抗菌活性不明显。结论:成功纯化GST-颗粒溶解素融合蛋白,该蛋白对革兰阳性菌具有高效抗菌活性。

关键词：大肠埃希菌颗粒溶解素融合表达纯化抗菌作用

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刚地弓形虫基因型与毒力关系的研究进展

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国际医学寄生虫病杂志 2007年第2期34卷 85-88页

作者：乔增培沈继龙安徽医科大学人兽共患病研究所、安徽医科大学病原生物学教研室、省部共建教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室合肥230032

弓形虫是一种专性有核细胞内的寄生原虫，可以感染包括人类在内的几乎所有温血动物。弓形虫不同虫株基因组之间存在微小差异，这可能是导致不同虫株对小鼠急性毒力差异的原因。近年来，对弓形虫基因组的研究主要集中在一些编码毒力相关... 详细信息

弓形虫是一种专性有核细胞内的寄生原虫，可以感染包括人类在内的几乎所有温血动物。弓形虫不同虫株基因组之间存在微小差异，这可能是导致不同虫株对小鼠急性毒力差异的原因。近年来，对弓形虫基因组的研究主要集中在一些编码毒力相关的重要的抗原基因。各分离株基因组之间只有1％。2％的差异，这种差异在各不同虫株间较稳定。弓形虫株大多数属于Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型中的一种，只有Ⅰ型是公认的小鼠强毒株，其余两型属弱毒株。目前的观察认为弓形虫基因组的变异度要比表型的变异度小。该文综述了与虫株毒力表型密切相关的基因，如SAG1，SAG2和SAG5等。越来越多的研究表明，造成弓形虫表型差异的因素并非单一的，而是若干基因共同作用的结果。

关键词：弓形虫基因组毒力

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增强型绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫成虫体内的瞬时表达

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中国人兽共患病学报 2006年第1期22卷 18-21页

作者：袁小松沈继龙汪学龙董慧芬蒋明森安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室合肥230032 武汉大学医学院病原生物学教研室

目的探讨异源性增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在日本血吸虫成虫体内表达的可能性。方法运用电穿孔技术将质粒pEGFP-C1导入日本血吸虫成虫体内,提取分离体外培养48小时成虫的基因组DNA、总RNA和全虫蛋白,分别用PCR、RT-PCR和Western blo... 详细信息

目的探讨异源性增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在日本血吸虫成虫体内表达的可能性。方法运用电穿孔技术将质粒pEGFP-C1导入日本血吸虫成虫体内,提取分离体外培养48小时成虫的基因组DNA、总RNA和全虫蛋白,分别用PCR、RT-PCR和Western blot验证转基因在成虫体内的存在、转录和翻译。同时,使用激光共聚焦扫描显微镜对EGFP在成虫体内进行定位。结果PCR和RT-PCR分别成功的扩增出760bp和276bp的预期大小的片断,Western-blot证实了EGFP基因在成虫体内的表达;激光共聚焦显微镜观察到,EGFP主要定位在成虫的皮层,口吸盘和尾部尤为明显。结论电穿孔技术成功地将异源基因引入日本血吸虫成虫体内并获得表达,为转基因血吸虫和基因功能的研究打下基础。

关键词：电穿孔技术增强型绿色荧光蛋白转基因血吸虫

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