检索结果-内蒙古大学图书馆

中国人兽共患病学报 2015年第1期31卷 57-63页

作者：王书书计永胜沈继龙安徽病原生物学省级实验室和人兽共患病安徽省重点实验室(安徽医科大学) 合肥230032 安徽医科大学免疫教研室和病原生物学教研室合肥230032 安徽医科大学附属省立医院儿内科合肥230001

自身免疫性疾病(ADs)是以特定的靶器官或多个器官系统的慢性损害和功能障碍为特征,临床上缺乏有效的治疗方法,目前发病率逐年升高,严重威胁人类健康。现有数据显示,血吸虫感染或注射血吸虫相关蛋白可能保护或减轻机体免受自身免疫性疾... 详细信息

自身免疫性疾病(ADs)是以特定的靶器官或多个器官系统的慢性损害和功能障碍为特征,临床上缺乏有效的治疗方法,目前发病率逐年升高,严重威胁人类健康。现有数据显示,血吸虫感染或注射血吸虫相关蛋白可能保护或减轻机体免受自身免疫性疾病的损害。研究学者已经建立相应的小鼠自身免疫疾病模型,证实了注射血吸虫蛋白具有诱导宿主Th2免疫偏移,下调Th17反应,并诱导旁路途经活化的巨噬细胞,从而减轻自身免疫性疾病,具有肯定的治疗效果。在这篇综述中,我们总结了血吸虫感染及血吸虫相关蛋白与减轻Th1介导的自身免疫性疾病之间的关系,力争明确其潜在的免疫保护机制。

关键词：自身免疫性疾病血吸虫 Th1Th2应答

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高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫株的建立及鉴定

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2015年第1期33卷 14-18页

作者：蒋宗儒安然杨杰万俐娟都建安徽医科大学基础医学院生化与分子生物学教研室安徽医科大学第一临床学院安徽病原生物学省级实验室合肥230032

目的构建并鉴定高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)虫株。方法 RTPCR扩增刚地弓形虫RH株速殖子的ROP18基因片段。将纯化的PCR产物克隆至p CR-BluntⅡ-Topo载体构建p ROP18质粒,PCR扩增ROP18基因序列。将纯化的PC... 详细信息

目的构建并鉴定高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)虫株。方法 RTPCR扩增刚地弓形虫RH株速殖子的ROP18基因片段。将纯化的PCR产物克隆至p CR-BluntⅡ-Topo载体构建p ROP18质粒,PCR扩增ROP18基因序列。将纯化的PCR产物亚克隆至p TUB8-myc GFPPftail-Ty1载体,构建p TUB8-ROP18-Ty1质粒。将质粒电穿孔转染刚地弓形虫RH株,刚地弓形虫悬液转移到长有贴壁细胞的培养瓶中培养,用含25μg/ml霉酚酸和50μg/ml黄嘌呤的DMEM培养基筛选高表达ROP18的刚地弓形虫RH株。免疫荧光和蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP18在转基因刚地弓形虫株中的表达。吉氏染色比较弓形虫RH株和高表达ROP18的转基因RH株弓形虫分别感染人包皮成纤维细胞(HFF细胞)的增殖情况。20只昆明小鼠均分为2组,每鼠分别腹腔内注射1×103高表达ROP18弓形虫RH株和1×103弓形虫RH株,统计小鼠存活率。结果 RT-PCR扩增出1 665 bp的ROP18基因序列。经酶切和测序鉴定证明p TUB8-ROP18-Ty1质粒构建成功。Western blotting分析结果显示,高表达ROP18 RH株可表达相对分子质量(Mr)为56 000的蛋白,与ROP18-Ty1蛋白预期结果一致。免疫荧光结果发现,ROP18-Ty1定位于弓形虫前端的棒状体。吉氏染色结果表明,高表达ROP18 RH株弓形虫感染HFF细胞6、12和24 h后的速殖子数量分别为100.0±16.9、476.0±31.1和860.0±52.3,均显著高于RH株弓形虫(88.0±16.9,300.0±11.3,675.0±35.4)(P<0.05)。弓形虫毒力实验结果显示,RH株弓形虫感染小鼠在第8天均存活,第14天存活率下降至30%(3/10),至第16天全部死亡;高表达ROP18 RH株弓形虫感染小鼠在第5天均存活,第8天存活率下降至30%(3/10),至第9天全部死亡。结论构建了高表达毒力因子ROP18的转基因弓形虫虫株。

关键词：弓形虫 ROP18基因转基因虫株

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淮河干流浮游动物群落结构特征

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湖泊科学 2015年第5期27卷 932-940页

作者：吴利李源玲陈延松合肥师范学院生命科学学院合肥230061 安徽病原生物学省级实验室和人兽共患病安徽省重点实验室(安徽医科大学) 安徽医科大学病原生物学教研室合肥230022

2011年3、6、9和12月对淮河干流11个采样点的浮游动物群落结构进行调查研究,共检出浮游动物79属206种,其中原生动物27属69种,占浮游动物总物种数的33.5%;轮虫35属104种,占50.5%;枝角类12属27种,占13.1%;桡足类5属6种,占2.9%.总体上看,... 详细信息

2011年3、6、9和12月对淮河干流11个采样点的浮游动物群落结构进行调查研究,共检出浮游动物79属206种,其中原生动物27属69种,占浮游动物总物种数的33.5%;轮虫35属104种,占50.5%;枝角类12属27种,占13.1%;桡足类5属6种,占2.9%.总体上看,从上游至下游,浮游动物物种数呈现逐渐减少的趋势.浮游动物的丰度和生物量分别为3527447 ind./L和2452 mg/L,轮虫和原生动物丰度是淮河干流浮游动物丰度的主体,轮虫生物量是淮河干流浮游动物生物量的主体,浮游动物及各类群丰度和生物量均表现为从上游到中游逐渐增高的趋势,而从中游到下游呈现逐渐降低的趋势.上游浮游动物多样性指数和均匀度指数高于中、下游.结果表明:淮河干流上游水质为轻污染,中、下游水质为中污染或重污染.浮游动物群落结构和环境因子的冗余分析表明,水温、溶解氧和流速是与淮河干流浮游动物群落结构相关性较强的环境因子.

关键词：浮游动物群落结构水质淮河干流

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金丝桃素体外抗弓形虫速殖子的实验研究

金丝桃素体外抗弓形虫速殖子的实验研究

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第八届北京热带医学与寄生虫学论坛

作者：杨小迪宋迪吴琦王旗计永胜薛洪宝孙希萌陈兴智蚌埠医学院病原生物学教研室安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠 233030 安徽医科大学病原生物学教研室安徽省人兽共患病重点实验室合肥 230032 蚌埠医学院化学教研室蚌埠 233030 首都医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室北京100069

目的观察金丝桃素对体外培养的弓形虫RH 株速殖子的杀伤作用,探讨金丝桃素抗弓形虫的效果及杀虫机制.方法将实验按药物(金丝桃素)浓度分为四组,即生理盐水组为A 组即对照组、药物浓度为5ug/ml、50ug/ml、500ug/ml 各为B 组、C 组和D ... 详细信息

目的观察金丝桃素对体外培养的弓形虫RH 株速殖子的杀伤作用,探讨金丝桃素抗弓形虫的效果及杀虫机制.方法将实验按药物(金丝桃素)浓度分为四组,即生理盐水组为A 组即对照组、药物浓度为5ug/ml、50ug/ml、500ug/ml 各为B 组、C 组和D 组,分别置入到(含弓形虫速殖子1×106个/ml)的24 孔培养板中,于2h、4h、6h 收集虫体,用台盼蓝染色法检测弓形虫速殖子着色率;吉姆萨染色法观察其形态和结构变化,透射电镜观察虫体超微结构,流式细胞仪检测虫体的存活状态.结果速殖子经不同浓度金丝桃素(5ug/ml、50ug/ml、500ug/ml)作用后,B 组、C组和D 组的台盼蓝着色率在2h 分别为(11.00±3.60)％、(25.00±6.25)％和(40.00±2.65)％,D组着色率显著高于C 组和B 组(P＜0.01),各组均高于A 组(6.00±3.00)％,但B 组和A 组之间无明显差异;作用4h后,D组着色率(97.00±2.00)％显著高于C 组(30.00±7.21)％、B组(20.00±3.00)％和A 组(10.00±1.00)％(P＜0.01);6h 后,D 组着色率(98.00±1.73)％亦高于C 组(42.67±5.50)％、B 组(34.00±6.56)％和A 组(19.33±4.93)％,且各组之间均有显著性差异(P＜0.01).Giemsa染色观察,随时间的延长及剂量的增加,弓形虫两端逐渐变圆、肿胀、坏死;透射电镜观察随时间延长,速殖子逐渐出现肿胀,胞膜与基质之间有明显空隙,虫体内空泡变多变大,胞膜破裂,内部结构溶解;流式细胞仪检测结果表明：弓形虫存活率在药物作用后的各时间段内与对照组相比差异显著(P＜0.01);药物作用2h后,C 组弓形虫存活率(7.91±1.86)％显著低于B 组(38.10±5.47)％和A组(81.84±6.02)％(P＜0.01);4h和6h后,B组弓形虫存活率分别为(14.32±7.89)％和(1.37±1.76)％明显低于A 组(73.80±11.33)％和(64.11±14.37)％(P＜0.01);C 组在4h 后达到最低值,D 组则在2h 即达到最低值.结论金丝桃素具有显著的体外抗弓形虫效应,效果与时间和剂量呈依赖关系.

关键词：金丝桃素刚地弓形虫体外

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弓形虫ROP16_(Ⅰ/Ⅲ)DNA疫苗不能诱导小鼠有效的保护性免疫

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中国人兽共患病学报 2015年第11期31卷 1010-1016页

作者：周芹芝李曼陈鹤都建罗庆礼沈继龙安徽医科大学病原生物学教研室安徽省人兽共患病重点实验室安徽病原生物学省级实验室合肥230032 中铁四局集团中心医院检验科合肥230000 安徽医科大学第一附属医院合肥230032

目的利用ROP16I/III基因真核表达重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠体液免疫和细胞免疫,评估ROP16I/III作为潜在的分子疫苗的价值。方法克隆Chinese 1型弓形虫ROP16I/III,将其插入真核表达载体pEGFP-C2中构建重组质粒pEGFP-ROP16I/I... 详细信息

目的利用ROP16I/III基因真核表达重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠体液免疫和细胞免疫,评估ROP16I/III作为潜在的分子疫苗的价值。方法克隆Chinese 1型弓形虫ROP16I/III,将其插入真核表达载体pEGFP-C2中构建重组质粒pEGFP-ROP16I/III,脂质体法转染T293细胞并观察体外表达。Western blotting分析鉴定。将36只SPF级小鼠随机均分为:1PBS组;2空质粒组;3pEGFP-ROP16I/III组。每2周肌注免疫1次(100μg/只),共3次;于免疫前及每次肌注前1d和末次免疫后2周收集小鼠血清,间接ELISA法检测血清抗弓形虫IgG。于末次免疫2周后取小鼠脾脏,分离淋巴细胞培养测细胞因子。剩余小鼠腹腔注射Chinese 1型弓形虫Wh3株速殖子1 000个/只,观察小鼠攻击感染后的存活时间和存活率。结果真核表达载体构建成功,体外见到重组质粒pEGFP-ROP16I/III在T293细胞的表达;pEGFP-ROP16I/III末次免疫后血清中IgG水平及脾淋巴细胞细胞因子均无明显升高(P>0.05);攻击感染后,免疫组小鼠比对照组的存活时间无延长(P>0.05);生物信息学分析发现ROP16I/III缺乏线性B细胞表位。结论 Chinese1型弓形虫的ROP16I/III由于其分泌的定位和结构特点,不能诱导小鼠产生有效的抗Wh3株攻击感染的免疫保护。

关键词：弓形虫 ROP16Ⅰ/Ⅲ 分子疫苗

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TXNIP和CEA联合检测对良恶性胸腔积液的诊断价值

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安徽医科大学学报 2015年第3期50卷 341-344页

作者：袁杰清束军王丹平沈继龙安徽医科大学第四附属医院呼吸内科合肥230022 安徽病原生物学省级实验室和人兽共患病安徽重点实验室(安徽医科大学基础医学院病原生物学教研室) 合肥230032

目的探讨硫氧还蛋白结合蛋白(TXNIP)、癌胚抗原(CEA)联合检测在良、恶性胸腔积液鉴别诊断中价值。方法收集57例胸腔积液患者(良性32例,恶性25例)的临床资料,采用ELISA法测定血清和胸腔积液中TXNIP和CEA浓度水平。结果恶性胸腔积液中TXNI... 详细信息

目的探讨硫氧还蛋白结合蛋白(TXNIP)、癌胚抗原(CEA)联合检测在良、恶性胸腔积液鉴别诊断中价值。方法收集57例胸腔积液患者(良性32例,恶性25例)的临床资料,采用ELISA法测定血清和胸腔积液中TXNIP和CEA浓度水平。结果恶性胸腔积液中TXNIP浓度明显低于良性胸腔积液中的含量;良恶性胸腔积液患者的血清中TXNIP浓度水平差异无统计学意义。TXNIP浓度89.57μg/L为最佳临界值,恶性胸腔积液的诊断灵敏度76%,特异度87.5%,符合率86.96%;CEA浓度5.285μg/L为最佳临界值,恶性胸腔积液的诊断灵敏度88%,特异度90.6%,符合率91.23%。联合试验,并联诊断的灵敏度为97.12%,特异度为79.28%;串联诊断灵敏度为66.88%,特异度98.83%。结论 TXNIP对恶性胸腔积液的诊断具有一定价值,与CEA联合检测可以提高诊断灵敏度与特异度。但是TXNIP对恶性胸腔积液的诊断价值并不优于CEA。

关键词：硫氧还蛋白结合蛋白癌胚抗原胸腔积液诊断

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日本血吸虫过氧化物氧化还原蛋白SjPrxⅠ的原核表达及其免疫调节功能

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中华疾病控制杂志 2015年第8期19卷 835-838页

作者：张奕陈鹤刘芳谢园园王书书沈继龙徐元宏安徽医科大学第一附属医院检验科安徽合肥230022 安徽省病原生物学省级实验室安徽合肥230022

目的对日本血吸虫氧化还原蛋白(peroxiredoxin of schistosoma japonicum,SjPrx)的表达、纯化,接种小鼠和体外刺激脾细胞,研究SjPrx I在体内外诱导免疫应答的作用及可能机制。方法 Gen Bank获取SjPrx编码序列,设计合成引物进行PCR扩增;... 详细信息

目的对日本血吸虫氧化还原蛋白(peroxiredoxin of schistosoma japonicum,SjPrx)的表达、纯化,接种小鼠和体外刺激脾细胞,研究SjPrx I在体内外诱导免疫应答的作用及可能机制。方法 Gen Bank获取SjPrx编码序列,设计合成引物进行PCR扩增;构建质粒,通过转化将构建的重组质粒转入感受态细胞,然后小量扩增菌株,电泳检测克隆成功表达。蛋白质印迹法(western blot,WB)验证融合蛋白后大量表达纯化。将重组SjPrxⅠ通过腹腔注射BALB/c小鼠,本科联免疫吸附实验和流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测脾细胞分泌细胞因子。结果成功构建了SjPrx I-p ET28a质粒,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达后得到可溶性SjPrx I,纯化后的SjPrxⅠ免疫小鼠,其淋巴细胞高水平表达Th2细胞分泌的IL-4(t=6.69,P<0.001)、IL-10(z=3.18,P=0.001)和IL-13(t=4.21,P=0.001)。结论制备了重组SjPrx I,初步认为其具有Th2型免疫调节功能,但并不能显著抑制体内业已存在的Th1的偏移。

关键词：血吸虫,日本过氧化物氧化还原蛋白 Th2型免疫应答

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某医院2012-2013年242株肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶及整合子耐药基因检测

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中国人兽共患病学报 2015年第5期31卷 437-440,452页

作者：郭普贺晓珊梅传忠李兴武刘双成沈继龙蚌埠医学院第一附属医院检验科蚌埠233004 蚌埠医学院医学检验系蚌埠233003 安徽病原生物学省级实验室和人兽共患病安徽省重点实验室安徽医科大学病原学教研室合肥230032

目的了解肺炎克雷伯菌主要的β-内酰胺酶和整合子耐药基因型,明确其耐药特性。方法回顾性分析我院2012年1月至2013年5月临床分离的242株肺炎克雷伯菌药敏结果,聚合酶链反应(PCR)检测其β-内酰胺酶及整合子耐药基因。结果 242株肺炎克雷... 详细信息

目的了解肺炎克雷伯菌主要的β-内酰胺酶和整合子耐药基因型,明确其耐药特性。方法回顾性分析我院2012年1月至2013年5月临床分离的242株肺炎克雷伯菌药敏结果,聚合酶链反应(PCR)检测其β-内酰胺酶及整合子耐药基因。结果 242株肺炎克雷伯菌对16种抗生素存在不同程度的耐药,其中氨曲南、头孢唑啉、氨苄西林/舒巴坦、头孢曲松和头孢他啶耐药率较高,分别为76.86%、65.70%、63.64%、62.40%和59.92%;亚胺培南、丁胺卡那、厄他培南和哌拉西林/他唑巴坦较为敏感,分别为17.77%、18.88%、18.88%和23.55%。PCR结果显示,ESBLs基因阳性155株,占64.05%,主要为TEM型和SHV型,两者均存在的菌株有114株,占产ESBLs基因菌株的73.55%(114/155)。其次为KPC基因86株,占35.54%;此外AmpC基因43株,占17.77%,全部为DHA型。整合子基因128株,占52.89%,以整合子1(intI-1)为主,共检出120株,占49.59%。结论我院肺炎克雷伯菌耐药情况严重,主要的耐药基因型为TEM型、SHV型、KPC和intI-1。

关键词：肺炎克雷伯菌耐药基因聚合酶链反应(PCR)

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日本血吸虫重组蛋白Cystatin保护小鼠结肠炎及其机制研究

日本血吸虫重组蛋白Cystatin保护小鼠结肠炎及其机制研究

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中国动物学会寄生虫学专业委员会第十五次全国学术会议暨第六次国际寄生虫学学术研讨会

作者：王书书谢园园闫珂沈继龙安徽病原生物学省级实验室人兽共患病安徽省重点实验室(安徽医科大学)安徽医科大学免疫教研室病原生物学教研室

目的探讨日本血吸虫重组蛋白(r Sjcystatin)对TNBS诱导的小鼠结肠炎的保护作用及其负向免疫调节机制。材料与方法 60只8周雌性BALB/c小鼠随机分为6组,每组10只,分别为:正常对照组、结肠炎模型组、r Sjcystatin提前干预组、r Sjcystatin... 详细信息

目的探讨日本血吸虫重组蛋白(r Sjcystatin)对TNBS诱导的小鼠结肠炎的保护作用及其负向免疫调节机制。材料与方法 60只8周雌性BALB/c小鼠随机分为6组,每组10只,分别为:正常对照组、结肠炎模型组、r Sjcystatin提前干预组、r Sjcystatin治疗组、r Sjcystatin提前干预对照组,及r Sjcystatin治疗对照组。小鼠轻度麻醉后,软管从肛门插入结肠4cm处,实验组小鼠注入乙醇稀释的TNBS0.1ml;正常组及干预对照组、治疗对照组以等体积生理盐水灌肠。提前干预组及相应对照组分别于造模前腹腔注射r Sjcystatin50μg共3次,每次间隔5天;治疗组及相应对照组分别于造模后6h和24h腹腔注射r Sjcystatin 50μg。造模3天后无痛处死小鼠,结肠病变进行炎症评分包括疾病症状评分(DAI)、结肠病变程度、病理分级、结肠组织髓过氧化物酶测定,并提取脾、肠系膜淋巴结及结肠粘膜固有层淋巴细胞,流式检测Th1(IFN-γ)、Th2(IL-4)、Th17(IL-17A)及Treg比例;q RT-PCR测定上述细胞因子的m RNA表达。结果 1、TNBS结肠炎模型小鼠第1天出现程度不同的稀便、黏液血便或血便,并伴有显著的体重下降;r Sjcystatin治疗组小鼠DAI、结肠病变程度评分及病理分级评分、MPO均明显低于结肠炎小鼠;而r Sjcystatin预防组小鼠结肠炎症指标与结肠炎模型组相比无差异(P>0.05);2、实验小鼠病变局部和脾脏细胞因子变化:1脾脏淋巴细胞:TNBS诱导的结肠炎组小鼠脾脏CD4IFNγ、CD4IL-17A占CD4比例分别为(2.92±0.54)%和(2.27±0.53)%,与正常小鼠相比显著增加(P<0.05);r Sjcystatin治疗组小鼠的脾淋巴细胞CD4IFNγ和CD4IL-17A比例下降,分别为(1.55±0.20)%和(1.75±0.49)%,且IL-17A m RNA表达水平(0.16±0.1)%较造模组有下调趋势,但未达到统计学差异;各组间脾脏淋巴细胞Treg、CD4IL-4占CD4比例、IL-10和TGF-β的m RNA表达水平均无统计学差异;2肠系膜淋巴结淋巴细胞(MLN):r Sjcystatin治疗组小鼠MLN中CD4IFNγ比例为(3.11±0.51)%,与造模组小鼠(4.00±0.85)%相比有所下降;治疗组MLN中Treg比例(9.82±0.85)%明显高于未治疗组(4.39±1.38)%和正常组小鼠(4.71±0.47)%,P<0.05;Foxp3 m RNA、TGF-βm RNA、IL-10m RNA表达较未治疗组增加(P<0.05);3结肠固有层淋巴细胞(LPMC):r Sjcystatin治疗组小鼠CD4IFNγ占CD4比例(2.77±0.80)%与未治疗组CD4IFN比例(8.23±0.90)%相比明显减少(P<0.05);r Sjcystatin治疗组LPMC的CD4CD25-Foxp3比例(5.25±1.51)%明显高于正常组(3.05±0.99)%和未治疗组(1.78±0.41)%,P<0.05。3、ELISA检测结肠组织匀浆上清中各因子水平:结肠炎未治疗组IFNγ(1628.6±358.81)pg/ml、IL-17水平(8214.4±2731.49)pg/ml相比正常对照组IFNγ(433.0±166.77)pg/ml、IL-17(1475.3±844.57)pg/ml显著升高(p<0.05);结肠炎治疗组IFNγ(1126.8±230.16)pg/ml明显下降、IL-4(159.95±30.66)pg/ml、IL-10(455.51±187.87)pg/ml、IL-13(8623.1±1644.19)pg/ml、TGF-β(116.18±17.68)pg/ml均较未治疗组显著升高(p<0.05)。结论 TNBS诱导的结肠炎小鼠提前给予日本血吸虫重组r Sjcystatin未见显著的预防作用;但是造模后给药能显著减轻TNBS诱导的小鼠结肠炎的病理损伤。其免疫调节机制可能是r Sjcystatin一定程度上下调结肠炎小鼠的Th1优势应答,在炎症局部可诱导Th2应答,同时上调肠系膜淋巴结和肠道调节性T细胞。r Sjcystatin具有减轻炎症性肠病病理损伤作用,对于其潜在的治疗炎症性肠病的价值尚待深入研究。

关键词：日本血吸虫 cystatin 结肠炎免疫调节

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弓形虫GRA15Ⅱ诱导的CAMs逆转小鼠日本血吸虫病肝纤维化的研究

弓形虫GRA15Ⅱ诱导的CAMs逆转小鼠日本血吸虫病肝纤维化的研究

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中国动物学会寄生虫学专业委员会第十五次全国学术会议暨第六次国际寄生虫学学术研讨会

作者：谢园园闫珂王书书刘芳储德勇沈继龙安徽病原生物学省级实验室人兽共患病安徽省重点实验室(安徽医科大学)安徽医科大学病原生物学教研室

目的:探讨弓形虫多态性致密颗粒蛋白GRA15活化的巨噬细胞CAMs对小鼠日本血吸虫肝纤维化的逆转作用及其机制。方法:从Ⅱ型弓形虫PRU株及Chinese 1型Wh3株中分别提取总RNA扩增GRA15和ROP16编码基因,构建重组质粒pegfp-gra15、pegfp-rop16... 详细信息

目的:探讨弓形虫多态性致密颗粒蛋白GRA15活化的巨噬细胞CAMs对小鼠日本血吸虫肝纤维化的逆转作用及其机制。方法:从Ⅱ型弓形虫PRU株及Chinese 1型Wh3株中分别提取总RNA扩增GRA15和ROP16编码基因,构建重组质粒pegfp-gra15、pegfp-rop16。体外实验:将该质粒亚克隆入慢病毒载体中并用该重组慢病毒感染小鼠细胞系RAW264.7,使之分别诱导极化为CAMs或AAMs。分别将GRA15-RAW264.7（A组）、ROP16I/I-RAW264.7（B组）、空白病毒载体（V-RAW264.7,C组）或未感染的RAW264.7（D组）与小鼠肝星状细胞系JS1 transwell共培养,观察上述四组JS1的增殖情况及α-Sma、ColⅠ和TGF-β1表达。体内实验:取100只7周雌性BALB/c小鼠随机分为5组,每组20只。分别设置为:A组为感染血吸虫对照组,在感染前7天及感染当日分别给予150μl生理盐水尾静脉高压注射;B组同对照组给予重悬于150μl生理盐水的2×106 GRA15-RAW264.7细胞;C组为同B组给予V-RAW264.7细胞;D组同B组给予RAW264.7细胞;E组为未感染对照组。在感染后八周无痛处死小鼠,留取标本。观察肝脏HE和Masson染色;检测肝脏羟脯氨酸Hyp、α-Sma、ColⅠ、TGF-β1、MMP13、i NOS、Arg-1表达量;检测血清纤维化指标透明质酸HA;检测脾细胞和血清中IFN-γ、TNF-α、TGF-β1、IL4和IL13表达量。结果:***15可驱动RAW264.7向CAMs极化,而ROP16I/I可诱导其向AAMs偏移。与对照组相比,GRA15-RAW264.7的TNF-α、IL12P40和i NOS的m RNA表达显著上调（P<0.05）;而TNF-α和i NOS的蛋白质水平检测亦见升高（P<0.05）。ROP16I/I-RAW264.7的IL10、TGF-β1、IL6和Arg-1的m RNA和蛋白质水平与对照组相比表达均升高（P<0.05）。2.体外共培养实验显示,GRA15-RAW264.7可抑制JS1增殖及分泌纤维化相关蛋白,而ROP16I/I-RAW264.7作用则相反。m RNA和蛋白水平检测均显示A组相对于C组和D组α-Sma和ColⅠ表达下调（P<0.05）;B与C组和D组比较,α-Sma和ColⅠ表达上调（P<0.05）;两组实验组均未见TGF-β1改变。另外m RNA和蛋白水平检测均显示GRA15-RAW264.7高表达MMP13（P<0.05）,ROP16I/I-RAW264.7则未见显著改变。3.体内试验肝纤维化指标检测结果显示,与对照组相比,GRA15-RAW264.7可减轻小鼠纤维化程度。表现为:肝脏虫卵肉芽肿减小（P<0.05）;Masson染色显示纤维化面积减小（P<0.05）;实验组肝组织α-Sma、ColⅠ和Arg-1的m RNA和蛋白水平表达下调（P<0.05）,MMP13和i NOS表达上调（P<0.05）。实验组血清HA与肝匀浆Hyp表达下调（P<0.05）。4.体内试验显示,GRA15-RAW264.7干预组小鼠呈现Th1偏移趋势。检测脾细胞m RNA水平以及检测血清及脾细胞上清蛋白水平显示IFN-γ和TNF-α表达上调,TGF-β1、IL4和IL13表达下调（P<0.05）。结论:弓形虫的多态性GRA15慢病毒感染RAW264.7,可驱动RAW264.7向CAMs极化,并且GRA15在宿主细胞内可稳定表达和持续传代。预先被动转输虫源性GRA15极化的CAMs可显著减轻日本血吸虫肝脏纤维化的程度。GRA15对宿主无明显毒副作用,为其应用研究提供了保障。

关键词：弓形虫致密颗粒蛋白GRA15 血吸虫病肝纤维化

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