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2005年寄生虫学国际学术研讨会暨中国动物学会寄生虫专业委员会第十次学术研讨会

作者：胡元生沈继龙安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室

目的在证明核酸疫苗Sj14-3-3具有部分抗血吸虫感染的基础上,联合使用CpG,mIL-12 和SjGST,观察此二种佐剂和SiGST的免疫效果及其抗血吸虫感染的初步机制。方法分别用①Sj14-3-3 组;②Sj14-3-3+SjGST组;③Sj14-3-3+mIL-12④Sj14-3-3+CpG... 详细信息

目的在证明核酸疫苗Sj14-3-3具有部分抗血吸虫感染的基础上,联合使用CpG,mIL-12 和SjGST,观察此二种佐剂和SiGST的免疫效果及其抗血吸虫感染的初步机制。方法分别用①Sj14-3-3 组;②Sj14-3-3+SjGST组;③Sj14-3-3+mIL-12④Sj14-3-3+CpG免疫小鼠,对照组:肌肉注射等容积的生理盐水。实验组②、③和④同时免疫SjGST、mIL-12和CpG各20μg/次/鼠。末次免疫后6 w周经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40±1条/鼠。尾蚴攻击感染后6w处死小鼠,行门静脉灌注冲洗收集成虫, 计算减虫率;并计数肝组织虫卵计算减卵率。常规ELISA方法检测血清抗Sj14-3-3特异性IgG、IgG1 和IgG2a抗体水平,用ELISA试剂盒测定小鼠脾细胞培养上清IFN-γ和IL-4的含量。流式细胞术检测小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞数量,计算CD4+/CD8+T细胞比率。结果配用不同佐剂/SjGST的重组Sj14-3-3核酸疫苗免疫BALB/c小鼠的结果表明:核酸疫苗佐剂/SjGST。mIL-12、SjGST及CpG均能够明显提高疫苗对小鼠抗血吸虫感染的保护性免疫作用,减虫率和减卵率均有所提高,减虫率:Sj14-3-3 组为28.7%,加过免疫佐剂/SjGST后各组的减虫率分别提高到:Sj14-3-3+mIL-12组为41.3%, Sj14-3-3+CpG组为37.1%,Sj14-3-3+SjGST组为39.2%;减卵率从19.9%分别提高到(按以上顺序): 52.6%,41.2%,39.6%;其中以佐剂mIL-12效果最好。Sj14-3-3核酸疫苗加入以上佐剂/SjGST后,均使血清特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平较单独Sj14-3-3核酸疫苗组有明显高。加入SjGST/佐剂组脾细胞培养上清(经不同刺激物:ConA和Sj14-3-3蛋白)的IFN-γ的含量均较单独使用Sj14-3-3核酸疫苗要高,小鼠IL-4的含量变化如下:在ConA刺激下,加SjGST/佐剂组较单独使用Sj14-3-3疫苗组要高, 但在用Sj14-3-3蛋白刺激时,各组变化不明显。流式细胞术检测结果:CD4+加SjGST/佐剂组中除了加入mIL-12组外,余下的均较单独使用Sj14-3-3核酸疫苗组有所升高,CD8+T细胞加SjGST/佐剂组均较单独使用Sj14-3-3核酸疫苗组高,因此,CD4+/CD8+T细胞的比率是加SjGST/佐剂的三组均较单独使用Sj14-3-3疫苗组要低。结论本研究证实SjGST和两种佐剂(mIL-12和CpG)均可以提高核酸疫苗Sj14-3-3对小鼠血吸虫感染的保护性免疫作用,它们主要通过增强体液免疫和/或细胞免疫机制发挥作用。

关键词：血吸虫病 14-3-3蛋白核酸疫苗佐剂谷胱苷肽-S-转移酶保护性免疫

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重组日本血吸虫14-3-3信号蛋白和GST用于急性血吸虫病的诊断

重组日本血吸虫14-3-3信号蛋白和GST用于急性血吸虫病的诊断

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2005年寄生虫学国际学术研讨会暨中国动物学会寄生虫专业委员会第十次学术研讨会

作者：罗庆礼沈继龙卞茂红刘淼余轶婧安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学第一附属医院输血科安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室

目的用重组日本血吸虫14-3-3蛋白和GST作为诊断抗原,建立间接ELISA法诊断急性血吸虫病。方法从日本血吸虫成虫cDNA文库中分别扩增出Sj14-3-3和SjGST编码基因,亚克隆至表达载体pET28a(+),诱导表达出rSj14-3-3和SjGST,分别将两种蛋白抗原... 详细信息

目的用重组日本血吸虫14-3-3蛋白和GST作为诊断抗原,建立间接ELISA法诊断急性血吸虫病。方法从日本血吸虫成虫cDNA文库中分别扩增出Sj14-3-3和SjGST编码基因,亚克隆至表达载体pET28a(+),诱导表达出rSj14-3-3和SjGST,分别将两种蛋白抗原纯化,Western blot鉴定。将两种蛋白作为抗原单独和联合应用包被ELISA反应板,通过棋盘滴定确定最适抗原浓度和血清的稀释度, 并对ELISA方法进行优化;然后对粪检血吸虫卵阳性病人血清和正常血清进行多次检测,确定ELISA 的阳性阈值(cut off值);最后用间接ELISA法将重组抗原、成虫粗制抗原分别对26份急性血吸虫病人血清、31份正常人血清、10份肝吸虫病人血清和5份旋毛虫病鼠血清进行检测,同时对这67份人血清和5份兔血清进行环卵沉淀试验(COPT)和间接血凝试验(IHA),比较重组抗原诊断急性血吸虫病的敏感性和特异性,以及交叉反应性,同时比较重组抗原与粗抗原,以及重组抗原间接ELISA法与其他方法的敏感性和特异性以及交叉反应性。结果经Western blot鉴定,rSj14-3-3和rSjGST可分别与抗rSj14-3-3和抗rSjGST单克隆抗体特异性反应。棋盘滴定法确定以0.1μg/孔重组蛋白进行包被,血清按1:10稀释,且根据多次ELISA检测结果得到cut off值为0.04。对以上急性血吸虫病人血清、正常人血清、肝吸虫病人血清和旋毛虫病鼠血清检测,阳性血清的检出率为91.6%,正常血清假阳性为3.1%, 与肝吸虫及旋毛虫血清无交叉反应。与成虫粗抗原对比分析,敏感性和特异性与成虫粗抗原(92%和3%)相一致。间接ELISA法与COPT和IHA两种方法比较,敏感性和特异性均优于后两者。结论建立了重组抗原rSj14-3-3/GST的间接ELISA法诊断急性血吸虫病的方法,为血吸虫病的早期诊断和治疗提供了技术支撑。。

关键词：日本血吸虫 14-3-3蛋白 GST 免疫诊断

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核酸探针的制备

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安徽医科大学学报 2005年第1期40卷 95-96页

作者：汪渊张孝林张素梅任传利熊江霞卜丽佳周青桂淑玉安徽医科大学分子生物学中心实验室和生物化学教研室安徽省基因研究重点实验室合肥230032 安徽医科大学第一附属医院呼吸内科

本实验室用地高辛-dUTP随机引物方法标记人内皮细胞特异性分子(human endothelial specific molecular-1，hESM-1)cDNA探针，并应用于ESM-1基因在肾癌中mRNA转录的检测。现报道如下。

关键词：人内皮细胞肾癌地高辛特异性核酸探针基因 cDNA探针随机引物 mRNA转录分子

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LPS对人脐静脉内皮细胞增殖和ESM-1表达的影响

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安徽医科大学学报 2005年第1期40卷 7-9页

作者：卜丽佳左莉任传利张素梅周青桂淑玉汪渊安徽医科大学分子生物学中心实验室和生物化学教研室安徽省基因研究重点实验室合肥230032 安徽医科大学第一附属医院呼吸内科合肥230022

目的探讨LPS对人脐静脉内皮细胞(ECV304)的生长和内皮细胞特异性分子-1(endothelial cell-specific molecule-1,ESM-1)表达的影响.方法在体外,用1 ml/L和5 ml/L的LPS在不同时间作用于ECV304,观察细胞形态的变化,用MTT法和免疫细胞化学... 详细信息

目的探讨LPS对人脐静脉内皮细胞(ECV304)的生长和内皮细胞特异性分子-1(endothelial cell-specific molecule-1,ESM-1)表达的影响.方法在体外,用1 ml/L和5 ml/L的LPS在不同时间作用于ECV304,观察细胞形态的变化,用MTT法和免疫细胞化学方法对细胞增殖和ESM-1、ERK、p-ERK在细胞中的表达.结果 LPS作用于ECV304 24 h后,细胞形态发生变化,梭形明显,排列紊乱.短时间内(0.5、1 h)LPS对ECV304有增殖作用.LPS可快速促进ESM-1的表达,在0.5、1 h时表达量较高.LPS作用后,ERK的表达无明显变化,但在一段时间(0.5～4 h)内ERK的磷酸化明显增加.结论 LPS对ECV304中ESM-1的表达有促进作用.推测ESM-1可能作为一种细胞因子与LPS在炎症反应中发挥着作用.

关键词： LPS 表达量 ERK 人脐静脉内皮细胞 ECV304 细胞形态增殖作用磷酸化免疫细胞化学方法变化

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DNA印迹试验

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安徽医科大学学报 2005年第2期40卷 194-196页

作者：汪渊左艳左莉刘虎张素梅熊江霞卜丽佳周青桂淑玉安徽医科大学分子生物学中心实验室和生物化学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学第一附属医院肿瘤科安徽医科大学第一附属医院呼吸内科合肥230022

DNA印迹是一种将电泳分离的DNA片段转移到固相支持物上用探针与靶DNA进行杂交的技术，又称Southem杂交。利用一种或多种限制内切酶酶切消化的基因组DNA，或经PCR获得扩增片段，经琼脂糖凝胶电泳，所得的DNA片段按分子大小分离，DNA片段... 详细信息

DNA印迹是一种将电泳分离的DNA片段转移到固相支持物上用探针与靶DNA进行杂交的技术，又称Southem杂交。利用一种或多种限制内切酶酶切消化的基因组DNA，或经PCR获得扩增片段，经琼脂糖凝胶电泳，所得的DNA片段按分子大小分离，DNA片段经琼脂糖凝胶、变性，并将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上(多为硝酸纤维素膜，NC或尼龙膜)，

关键词：印迹试验 Southem杂交 DNA片段琼脂糖凝胶电泳固相支持物基因组DNA 硝酸纤维素膜 DNA印迹限制内切酶靶DNA 电泳分离扩增片段分子大小 PCR 尼龙膜转移

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日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆和序列分析

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中国寄生虫病防治杂志 2005年第1期18卷 45-47页

作者：胡元生沈继龙汪学龙钟政荣沈继录李小月王家传江宝玲倪婧安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学第一附属医院安徽合肥230032

　目的　克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。　方法　以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸... 详细信息

　目的　克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。　方法　以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链,将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列,克隆入 pGEM T easy载体,用单酶双切法和DNA测序进行鉴定,并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。　结果　自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为 480 bp的 DNA片段,经测序与曼氏血吸虫 TH的同源性为 87%。结论　成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域,为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。

关键词：血吸虫,日本酪氨酸羟化酶基因克隆信号转导

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高脂血症对大鼠动脉肌球蛋白轻链激酶活性及表达的影响

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安徽医科大学学报 2005年第6期40卷 504-507页

作者：朱华庆程筱雯张慧周青桂淑玉汪渊安徽医科大学分子生物学实验室与生物化学教研室合肥230032 浙江树人大学生物环保学院杭州310015 安徽省基因研究重点实验室合肥230032

目的探讨高脂血症对大鼠动脉肌球蛋白轻链激酶活性及表达的影响。方法胆固醇喂食大鼠4周和12周,颈动脉取血后检测血清标本中血脂成分的变化,免疫组化和Westernblot分析动脉肌球蛋白轻链激酶的表达,γ32P参入法检测动脉肌球蛋白轻链激酶... 详细信息

目的探讨高脂血症对大鼠动脉肌球蛋白轻链激酶活性及表达的影响。方法胆固醇喂食大鼠4周和12周,颈动脉取血后检测血清标本中血脂成分的变化,免疫组化和Westernblot分析动脉肌球蛋白轻链激酶的表达,γ32P参入法检测动脉肌球蛋白轻链激酶活性。结果血清中各种脂质发生显著变化,大鼠在喂食胆固醇膳食4周和12周后动脉肌球蛋白轻链激酶表达显著增强,肌球蛋白轻链激酶活性显著升高。结论胆固醇对大鼠动脉肌球蛋白轻链激酶的表达与活性变化相关,肌球蛋白轻链激酶表达与活性变化可能是高脂血症形成的因素。

关键词：胆固醇膳食高脂血症肌球蛋白轻链激酶

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MtbAg体外激活扩增的人γδT细胞表面L-选择素的动态变化

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蚌埠医学院学报 2005年第3期30卷 192-194页

作者：武文娟沈继龙李柏青安徽医科大学病原生物学教研室安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室安徽蚌埠233003 安徽医科大学免疫学教研室安徽省感染与免疫重点实验室

目的:研究结核杆菌抗原(MtbAg)激活扩增的人外周血γδT细胞表面L 选择素(CD6 2L)的表达。方法:用MtbAg和rIL-2刺激人外周血单个核细胞(PBMC)促使γδT细胞增殖,用CD3单克隆抗体(CD3mAb)和rIL-2刺激人PBMC促使αβT细胞增殖。取新鲜PBM... 详细信息

目的:研究结核杆菌抗原(MtbAg)激活扩增的人外周血γδT细胞表面L 选择素(CD6 2L)的表达。方法:用MtbAg和rIL-2刺激人外周血单个核细胞(PBMC)促使γδT细胞增殖,用CD3单克隆抗体(CD3mAb)和rIL-2刺激人PBMC促使αβT细胞增殖。取新鲜PBMC和刺激后培养3～2 1天的γδT细胞和αβT细胞,用多色荧光抗体标记,在流式细胞仪上检测γδT细胞表面CD6.2L的表达,并与αβT细胞作比较。结果:新鲜未刺激PBMC中γδT细胞CD6 2L表达率为4 3.9% ,明显低于αβT细胞的76 .6 % ;用MtbAg或CD3Ab激活后培养第6天时CD6 2L在γδT细胞的表达(90 .7% )和在αβT细胞表达(87.2 % )均达到高峰;以后CD6 2L表达逐渐下降,15～2 1天γδT细胞CD6 2L的表达在低水平(16 .2 %～10 .6 % )维持,αβT细胞表面的CD6 2L表达(2 3.6 %～17.5 % )亦在低水平维持。结论:新鲜PBMC中γδT细胞CD6 2L表达明显低于αβT细胞,但在激活后增殖过程中CD6 2L在γδT细胞的表达,与αβT细胞相似,呈现先上升再下降的趋势。

关键词：结核杆菌 γδ-细胞 L-选择素流式细胞术

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红细胞碎片对白细胞计数结果的影响

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临床输血与检验 2005年第1期7卷 15-17页

作者：钟政荣沈继龙李兴武张凡 230032 合肥安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室蚌埠医学院附属医院检验科

目的分析在CD-1700型血液分析仪上作白细胞(WBC)计数检测时,在35 fl线附近出现一匕首样峰的异常白细胞直方图和不准确的白细胞计数结果的原因.方法对20例(肝病患者18例,新生儿2例)异常白细胞直方图的可能原因进行逐一分析;采用制片染色... 详细信息

目的分析在CD-1700型血液分析仪上作白细胞(WBC)计数检测时,在35 fl线附近出现一匕首样峰的异常白细胞直方图和不准确的白细胞计数结果的原因.方法对20例(肝病患者18例,新生儿2例)异常白细胞直方图的可能原因进行逐一分析;采用制片染色作显微镜检查,用稀释液洗涤红细胞后再用仪器检测和进行红细胞渗透脆性试验,同时对这些标本用显微镜目测法计数WBC,并与计数法结果进行配对t检验.结果出现异常直方图的WBC计数结果与目测法结果的差异有显著性(P＜0.01),仪器法结果显著增高,且这些标本的红细胞渗透脆性均显著降低. 结论白细胞计数假性增高与红细胞膜脆性变化密切相关.建议出现异常白细胞直方图时,须用显微镜目测法计数白细胞.

关键词：红细胞膜脆性直方图白细胞计数

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非霍奇金淋巴瘤组织中ESM-1和VEGF的表达及意义

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安徽医药 2005年第2期9卷 104-105页

作者：倪婧吴正升吴强张素梅周青汪渊夏瑞祥安徽医科大学第一附属医院血液科安徽合肥230022 安徽医科大学病理学教研室安徽合肥230032 安徽医科大学分子生物学实验室安徽省基因研究重点实验室安徽合肥230032

目的　研究ESM 1和VEGF在非霍奇金淋巴瘤中的表达及其意义。方法　采用免疫组化S P法对例 4 1例非霍奇金淋巴瘤组织和 10例正常淋巴结中ESM 1和VEGF的表达情况进行检测。结果　在非霍奇金淋巴瘤中ESM 1和VEGF的表达率分别为 82 9%和 6 ... 详细信息

目的　研究ESM 1和VEGF在非霍奇金淋巴瘤中的表达及其意义。方法　采用免疫组化S P法对例 4 1例非霍奇金淋巴瘤组织和 10例正常淋巴结中ESM 1和VEGF的表达情况进行检测。结果　在非霍奇金淋巴瘤中ESM 1和VEGF的表达率分别为 82 9%和 6 5 9% ,两者的表达呈正相关。结论　ESM 1和VEGF可能在淋巴瘤的发生发展过程中起一定的作用 ,可作为潜在的预后指标。

关键词：非霍奇金淋巴瘤瘤组织 ESM-1 VEGF 基因表达免疫组化

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