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2005年寄生虫学国际学术研讨会暨中国动物学会寄生虫专业委员会第十次学术研讨会

作者：王家传蒋作君沈继龙汪学龙安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室

弓形虫是细胞内的寄生原虫,对免疫功能受损者和孕妇造成危害严重,而在免疫功能正常的人群感染后多呈无症状的带虫状态。免疫血清诊断是当前弓形虫感染实验室诊断的主要手段,目前尚无实用的分子疫苗。有关弓形虫强毒RH株的抗原及抗感染... 详细信息

弓形虫是细胞内的寄生原虫,对免疫功能受损者和孕妇造成危害严重,而在免疫功能正常的人群感染后多呈无症状的带虫状态。免疫血清诊断是当前弓形虫感染实验室诊断的主要手段,目前尚无实用的分子疫苗。有关弓形虫强毒RH株的抗原及抗感染免疫机制较多,而事实上,人体和大部分动物感染均为弱毒虫株。为了筛选弱毒株相关抗原,我们用弓形虫成囊株(Prugniaud株)感染的小鼠血清筛选弓形虫RH株速殖子cDNA文库,以寻找诊断弓形虫病的抗原和保护性抗原基因。以成囊株弓形虫包囊

关键词：弓形虫弱毒株 cDNA文库

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日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号蛋白的真核表达

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临床输血与检验 2005年第1期7卷 4-7页

作者：胡元生沈继龙安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室合肥230032

目的　从日本血吸虫成虫 c DNA中扩增出信号蛋白 Sj1 4-3 -3编码基因 ,并亚克隆至真核表达载体 pc DNA3 .1( +) ,旨在制备重组诊断抗原和分子疫苗。方法　提取日本血吸虫成虫总 RNA,分离m RNA,RT-PCR法制备c DNA,并扩增出 Sj1 4-3 -3编... 详细信息

目的　从日本血吸虫成虫 c DNA中扩增出信号蛋白 Sj1 4-3 -3编码基因 ,并亚克隆至真核表达载体 pc DNA3 .1( +) ,旨在制备重组诊断抗原和分子疫苗。方法　提取日本血吸虫成虫总 RNA,分离m RNA,RT-PCR法制备c DNA,并扩增出 Sj1 4-3 -3编码基因 ,通过线性 TA克隆载体 p GEM-T连接 ,亚克隆至真核表达载体 pc DNA3 .1 ( +) ,经转染至 COS-7细胞中表达 ,Western blotting鉴定。结果　RT-PCR产物、p GEM-T-Sj1 4-3 -3及 pc DNA3 .1 ( +) -Sj1 4-3 -3分别经双酶切后均获得一特异性基因片段 ,经 SDS-PAGE及 Western blotting鉴定后的分子量为 2 9k D。结论　真核表达重组质粒 pc DNA3 .1( +) -Sj1 4-3 -3在 COS-7细胞中的表达产物是一分子量为 2 9k D的蛋白 ,并能被抗 Sj1 4-3

关键词：日本血吸虫 14-3-3信号蛋白真核表达

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一个具有诊断价值的弓形虫基因的发现

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临床输血与检验 2005年第3期7卷 184-186页

作者：王家传蒋作君沈继龙汪学龙安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室合肥230032

目的用弓形虫成囊株感染的小鼠血清筛选弓形虫RH株速殖子cDNA文库,以寻找诊断弓形虫病的抗原基因。方法收集成囊株(Prugniaud株)慢性感染的小鼠血清,经滤膜吸附法去除大肠杆菌抗体,筛选弓形虫RH株速殖子cDNA文库。对3次复筛得到的阳性... 详细信息

目的用弓形虫成囊株感染的小鼠血清筛选弓形虫RH株速殖子cDNA文库,以寻找诊断弓形虫病的抗原基因。方法收集成囊株(Prugniaud株)慢性感染的小鼠血清,经滤膜吸附法去除大肠杆菌抗体,筛选弓形虫RH株速殖子cDNA文库。对3次复筛得到的阳性克隆进行插入片段的核苷酸序列测定,结果送GenBank进行同源性分析。根据序列测定结果,选取其中1个具有完整开放阅读框架的基因进行分析。结果获得4个持续阳性反应克隆。测序和同源性分析显示,WT1为弓形虫P30基因;WT4为弓形虫N-乙酰磷酸丙糖转移酶基因;WT9与已知的基因无同源性。WT12克隆基因与一未知的弓形虫基因有很高的同源性,且具有1个513bp大小的完整开放阅读框架,其蛋白质结构和功能预测可能是个跨膜信号蛋白。结论筛选得到的1个阳性克隆有望成为早期诊断抗原基因,值得进一步研究。

关键词：弓形虫 cDNA文库免疫学筛选阳性克隆分析

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Sj14-3-3核酸疫苗联合CpG,mIL-12和SjGST抗日本血吸虫感染的保护作用

Sj14-3-3核酸疫苗联合CpG,mIL-12和SjGST抗日本血吸虫感染的保护...

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2005年寄生虫学国际学术研讨会暨中国动物学会寄生虫专业委员会第十次学术研讨会

作者：胡元生沈继龙安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室

目的在证明核酸疫苗Sj14-3-3具有部分抗血吸虫感染的基础上,联合使用CpG,mIL-12 和SjGST,观察此二种佐剂和SiGST的免疫效果及其抗血吸虫感染的初步机制。方法分别用①Sj14-3-3 组;②Sj14-3-3+SjGST组;③Sj14-3-3+mIL-12④Sj14-3-3+CpG... 详细信息

目的在证明核酸疫苗Sj14-3-3具有部分抗血吸虫感染的基础上,联合使用CpG,mIL-12 和SjGST,观察此二种佐剂和SiGST的免疫效果及其抗血吸虫感染的初步机制。方法分别用①Sj14-3-3 组;②Sj14-3-3+SjGST组;③Sj14-3-3+mIL-12④Sj14-3-3+CpG免疫小鼠,对照组:肌肉注射等容积的生理盐水。实验组②、③和④同时免疫SjGST、mIL-12和CpG各20μg/次/鼠。末次免疫后6 w周经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40±1条/鼠。尾蚴攻击感染后6w处死小鼠,行门静脉灌注冲洗收集成虫, 计算减虫率;并计数肝组织虫卵计算减卵率。常规ELISA方法检测血清抗Sj14-3-3特异性IgG、IgG1 和IgG2a抗体水平,用ELISA试剂盒测定小鼠脾细胞培养上清IFN-γ和IL-4的含量。流式细胞术检测小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞数量,计算CD4+/CD8+T细胞比率。结果配用不同佐剂/SjGST的重组Sj14-3-3核酸疫苗免疫BALB/c小鼠的结果表明:核酸疫苗佐剂/SjGST。mIL-12、SjGST及CpG均能够明显提高疫苗对小鼠抗血吸虫感染的保护性免疫作用,减虫率和减卵率均有所提高,减虫率:Sj14-3-3 组为28.7%,加过免疫佐剂/SjGST后各组的减虫率分别提高到:Sj14-3-3+mIL-12组为41.3%, Sj14-3-3+CpG组为37.1%,Sj14-3-3+SjGST组为39.2%;减卵率从19.9%分别提高到(按以上顺序): 52.6%,41.2%,39.6%;其中以佐剂mIL-12效果最好。Sj14-3-3核酸疫苗加入以上佐剂/SjGST后,均使血清特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平较单独Sj14-3-3核酸疫苗组有明显高。加入SjGST/佐剂组脾细胞培养上清(经不同刺激物:ConA和Sj14-3-3蛋白)的IFN-γ的含量均较单独使用Sj14-3-3核酸疫苗要高,小鼠IL-4的含量变化如下:在ConA刺激下,加SjGST/佐剂组较单独使用Sj14-3-3疫苗组要高, 但在用Sj14-3-3蛋白刺激时,各组变化不明显。流式细胞术检测结果:CD4+加SjGST/佐剂组中除了加入mIL-12组外,余下的均较单独使用Sj14-3-3核酸疫苗组有所升高,CD8+T细胞加SjGST/佐剂组均较单独使用Sj14-3-3核酸疫苗组高,因此,CD4+/CD8+T细胞的比率是加SjGST/佐剂的三组均较单独使用Sj14-3-3疫苗组要低。结论本研究证实SjGST和两种佐剂(mIL-12和CpG)均可以提高核酸疫苗Sj14-3-3对小鼠血吸虫感染的保护性免疫作用,它们主要通过增强体液免疫和/或细胞免疫机制发挥作用。

关键词：血吸虫病 14-3-3蛋白核酸疫苗佐剂谷胱苷肽-S-转移酶保护性免疫

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重组日本血吸虫14-3-3信号蛋白和GST用于急性血吸虫病的诊断

重组日本血吸虫14-3-3信号蛋白和GST用于急性血吸虫病的诊断

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2005年寄生虫学国际学术研讨会暨中国动物学会寄生虫专业委员会第十次学术研讨会

作者：罗庆礼沈继龙卞茂红刘淼余轶婧安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学第一附属医院输血科安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室

目的用重组日本血吸虫14-3-3蛋白和GST作为诊断抗原,建立间接ELISA法诊断急性血吸虫病。方法从日本血吸虫成虫cDNA文库中分别扩增出Sj14-3-3和SjGST编码基因,亚克隆至表达载体pET28a(+),诱导表达出rSj14-3-3和SjGST,分别将两种蛋白抗原... 详细信息

目的用重组日本血吸虫14-3-3蛋白和GST作为诊断抗原,建立间接ELISA法诊断急性血吸虫病。方法从日本血吸虫成虫cDNA文库中分别扩增出Sj14-3-3和SjGST编码基因,亚克隆至表达载体pET28a(+),诱导表达出rSj14-3-3和SjGST,分别将两种蛋白抗原纯化,Western blot鉴定。将两种蛋白作为抗原单独和联合应用包被ELISA反应板,通过棋盘滴定确定最适抗原浓度和血清的稀释度, 并对ELISA方法进行优化;然后对粪检血吸虫卵阳性病人血清和正常血清进行多次检测,确定ELISA 的阳性阈值(cut off值);最后用间接ELISA法将重组抗原、成虫粗制抗原分别对26份急性血吸虫病人血清、31份正常人血清、10份肝吸虫病人血清和5份旋毛虫病鼠血清进行检测,同时对这67份人血清和5份兔血清进行环卵沉淀试验(COPT)和间接血凝试验(IHA),比较重组抗原诊断急性血吸虫病的敏感性和特异性,以及交叉反应性,同时比较重组抗原与粗抗原,以及重组抗原间接ELISA法与其他方法的敏感性和特异性以及交叉反应性。结果经Western blot鉴定,rSj14-3-3和rSjGST可分别与抗rSj14-3-3和抗rSjGST单克隆抗体特异性反应。棋盘滴定法确定以0.1μg/孔重组蛋白进行包被,血清按1:10稀释,且根据多次ELISA检测结果得到cut off值为0.04。对以上急性血吸虫病人血清、正常人血清、肝吸虫病人血清和旋毛虫病鼠血清检测,阳性血清的检出率为91.6%,正常血清假阳性为3.1%, 与肝吸虫及旋毛虫血清无交叉反应。与成虫粗抗原对比分析,敏感性和特异性与成虫粗抗原(92%和3%)相一致。间接ELISA法与COPT和IHA两种方法比较,敏感性和特异性均优于后两者。结论建立了重组抗原rSj14-3-3/GST的间接ELISA法诊断急性血吸虫病的方法,为血吸虫病的早期诊断和治疗提供了技术支撑。。

关键词：日本血吸虫 14-3-3蛋白 GST 免疫诊断

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MtbAg体外激活扩增的人γδT细胞表面L-选择素的动态变化

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蚌埠医学院学报 2005年第3期30卷 192-194页

作者：武文娟沈继龙李柏青安徽医科大学病原生物学教研室安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室安徽蚌埠233003 安徽医科大学免疫学教研室安徽省感染与免疫重点实验室

目的:研究结核杆菌抗原(MtbAg)激活扩增的人外周血γδT细胞表面L 选择素(CD6 2L)的表达。方法:用MtbAg和rIL-2刺激人外周血单个核细胞(PBMC)促使γδT细胞增殖,用CD3单克隆抗体(CD3mAb)和rIL-2刺激人PBMC促使αβT细胞增殖。取新鲜PBM... 详细信息

目的:研究结核杆菌抗原(MtbAg)激活扩增的人外周血γδT细胞表面L 选择素(CD6 2L)的表达。方法:用MtbAg和rIL-2刺激人外周血单个核细胞(PBMC)促使γδT细胞增殖,用CD3单克隆抗体(CD3mAb)和rIL-2刺激人PBMC促使αβT细胞增殖。取新鲜PBMC和刺激后培养3～2 1天的γδT细胞和αβT细胞,用多色荧光抗体标记,在流式细胞仪上检测γδT细胞表面CD6.2L的表达,并与αβT细胞作比较。结果:新鲜未刺激PBMC中γδT细胞CD6 2L表达率为4 3.9% ,明显低于αβT细胞的76 .6 % ;用MtbAg或CD3Ab激活后培养第6天时CD6 2L在γδT细胞的表达(90 .7% )和在αβT细胞表达(87.2 % )均达到高峰;以后CD6 2L表达逐渐下降,15～2 1天γδT细胞CD6 2L的表达在低水平(16 .2 %～10 .6 % )维持,αβT细胞表面的CD6 2L表达(2 3.6 %～17.5 % )亦在低水平维持。结论:新鲜PBMC中γδT细胞CD6 2L表达明显低于αβT细胞,但在激活后增殖过程中CD6 2L在γδT细胞的表达,与αβT细胞相似,呈现先上升再下降的趋势。

关键词：结核杆菌 γδ-细胞 L-选择素流式细胞术

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日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆和序列分析

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中国寄生虫病防治杂志 2005年第1期18卷 45-47页

作者：胡元生沈继龙汪学龙钟政荣沈继录李小月王家传江宝玲倪婧安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室安徽医科大学第一附属医院安徽合肥230032

　目的　克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。　方法　以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸... 详细信息

　目的　克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。　方法　以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链,将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列,克隆入 pGEM T easy载体,用单酶双切法和DNA测序进行鉴定,并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。　结果　自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为 480 bp的 DNA片段,经测序与曼氏血吸虫 TH的同源性为 87%。结论　成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域,为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。

关键词：血吸虫,日本酪氨酸羟化酶基因克隆信号转导

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红细胞碎片对白细胞计数结果的影响

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临床输血与检验 2005年第1期7卷 15-17页

作者：钟政荣沈继龙李兴武张凡 230032 合肥安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室蚌埠医学院附属医院检验科

目的分析在CD-1700型血液分析仪上作白细胞(WBC)计数检测时,在35 fl线附近出现一匕首样峰的异常白细胞直方图和不准确的白细胞计数结果的原因.方法对20例(肝病患者18例,新生儿2例)异常白细胞直方图的可能原因进行逐一分析;采用制片染色... 详细信息

目的分析在CD-1700型血液分析仪上作白细胞(WBC)计数检测时,在35 fl线附近出现一匕首样峰的异常白细胞直方图和不准确的白细胞计数结果的原因.方法对20例(肝病患者18例,新生儿2例)异常白细胞直方图的可能原因进行逐一分析;采用制片染色作显微镜检查,用稀释液洗涤红细胞后再用仪器检测和进行红细胞渗透脆性试验,同时对这些标本用显微镜目测法计数WBC,并与计数法结果进行配对t检验.结果出现异常直方图的WBC计数结果与目测法结果的差异有显著性(P＜0.01),仪器法结果显著增高,且这些标本的红细胞渗透脆性均显著降低. 结论白细胞计数假性增高与红细胞膜脆性变化密切相关.建议出现异常白细胞直方图时,须用显微镜目测法计数白细胞.

关键词：红细胞膜脆性直方图白细胞计数

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日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其单克隆抗体用于诊断的价值

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中国人兽共患病杂志 2004年第10期20卷 847-850页

作者：查任远沈继龙汪学龙安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室合肥230032

目的探讨纯化的日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其相应单克隆抗体对日本血吸虫病的诊断价值。方法利用纯化的rSj14-3-3抗原和可溶性虫卵抗原(SEA)间接ELISA方法检测急、慢性日本血吸虫病患者血清中特异性抗体;以纯化的抗rSj1... 详细信息

目的探讨纯化的日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其相应单克隆抗体对日本血吸虫病的诊断价值。方法利用纯化的rSj14-3-3抗原和可溶性虫卵抗原(SEA)间接ELISA方法检测急、慢性日本血吸虫病患者血清中特异性抗体;以纯化的抗rSj14-3-3单克隆抗体包板,以兔抗rSj14-3-3多抗和酶标羊抗兔多抗为检测系统的酶标夹心法检测患者血清中的循环抗原。结果用rSj14-3-3检测急、慢性血吸虫病患者血清中特异性抗体的阳性率分别为100%和933%,用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原的阳性率分别为100%和956%,两者联合检测的总阳性率分别为100%和978%;经治疗后2、4、6、12个月,抗体转阴率分别为387%、548%、75%、90%,血清循环抗原转阴率分别为177%、419%、55%、85%,两者联合检测的总转阴率分别为452%、63%、85%、90%;对正常人血清的检测未见假阳性反应,与华支睾吸虫病和钩虫病患者血清出现轻微的交叉反应;用SEA检测抗体的阳性率分别为978%和956%,与正常人及华支睾吸虫病和钩虫病患者血清均有不同程度的交叉反应,治疗后2、4、6、12个月阴转率分别为32%、65%、125%、15%。结论rSj14-3-3检测急慢性血吸虫病患者血清中的特异性抗体和利用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原具有高度的特异性和敏感性。

关键词：日本血吸虫病免疫诊断重组sj14-3-3 单克隆抗体

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弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

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临床输血与检验 2004年第1期6卷 4-7页

作者：都建沈继龙汪学龙王维安徽医科大学病原生物学教研室安徽省基因研究重点实验室合肥230032

目的　体外扩增弓形虫 RH株膜表面抗原 SAG1编码基因 ,构建原核表达质粒 ,并表达 SAG1编码基因序列。方法　收集、纯化 RH株速殖子 ,提取 RNA,据已知的 SAG1基因序列 ,在设计合成的 1对引物中引入 Eco RI和 Hind 酶切位点。应用 RT-PCR... 详细信息

目的　体外扩增弓形虫 RH株膜表面抗原 SAG1编码基因 ,构建原核表达质粒 ,并表达 SAG1编码基因序列。方法　收集、纯化 RH株速殖子 ,提取 RNA,据已知的 SAG1基因序列 ,在设计合成的 1对引物中引入 Eco RI和 Hind 酶切位点。应用 RT-PCR技术 ,扩增 SAG1基因片段 ,插入原核表达质粒 p ET2 8a中 ,转化大肠杆菌 BL2 1 感受态细胞 ,重组子经 Eco RI和 Hind 双酶切、PCR鉴定 ,转化宿主菌 BL2 1 ,并以 IPTG诱导表达。结果　从弓形虫 RH株 RNA中扩增出 10 1 1 bp的 SAG1基因片段 ,构建重组质粒 p ET2 8a/ SAG1 ,酶切和 PCR鉴定产物大小均与预期值相符 ;IPTG诱导 ,SDS-PAGE显示表达产物的大小约 3 4.8k D。结论　成功地从弓形虫 RH株 RNA中获取 SAG1基因 ,构建了 p ET2 8a/ SAG1重组质粒并获得了高效表达。

关键词：弓形虫表面抗原 SAG1基因克隆大肠杆菌表达

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