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中国人兽共患病学报 2012年第3期28卷 209-212页

作者：钟政荣徐云侠宫继勇罗庆礼闻慧琴宋晓蓉沈继龙安徽省蚌埠医学院第一附属医院检验科蚌埠233004 安徽省蚌埠医学院第一附属医院神经内科蚌埠233004 安徽医科大学病原生物学教研室安徽省病原生物学省级实验室安徽省人兽共患病重点实验室合肥230032

目的探讨制备高纯度、高生物活性的的日本血吸虫卵分离方法。方法将匀浆后的血吸虫感染的兔肝组织悬液分级过滤,再将滤液离心,去除组织碎片,分离的虫卵再次经过325目分样筛过滤,收集筛上虫卵,最后将收集的虫卵用密度1.070的Percoll分离... 详细信息

目的探讨制备高纯度、高生物活性的的日本血吸虫卵分离方法。方法将匀浆后的血吸虫感染的兔肝组织悬液分级过滤,再将滤液离心,去除组织碎片,分离的虫卵再次经过325目分样筛过滤,收集筛上虫卵,最后将收集的虫卵用密度1.070的Percoll分离液梯度离心,吸取下层Percoll液中的纯化虫卵;显微镜观察分离虫卵的纯度,吖啶橙染色观察虫卵的死活,环卵沉淀试验鉴定虫卵的分泌活性。结果每个肝脏获得约1g左右的虫卵,分离的虫卵纯度高,吖啶橙染色和环卵沉淀试验结果显示,分离的活虫卵比例高、生物活性好。结论该虫卵分离方法操作简单、用时短、效果好,分离的虫卵完全满足各种研究的需要。

关键词：日本血吸虫虫卵分离纯化活性

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我国弓形虫分离株SAG3基因的比较及其毒力分析

我国弓形虫分离株SAG3基因的比较及其毒力分析

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2012年安徽省医学会微生物与免疫学、热带病与寄生虫病学会换届改选与学术研讨会

作者：王林蔡亦红张爱梅沈继龙黄开泉宋晓蓉徐修才余莉罗庆礼陈兆武霍星星安徽病原生物学省级实验室，人兽共患病安徽省重点实验室，安徽医科大学病原生物学教研室，合肥 230032 安徽中医学院第一附属医院检验中心，合肥 230031 安徽病原生物学省级实验室，人兽共患病安徽省重点实验室，安徽医科大学病原生物学教研室，合肥 230032 安徽医科大学附属省立医院安徽中医学院第一附属医院检验中心，合肥 230031

目的：探明流行我国刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)基因型分布及其对小鼠毒力，观察我国强毒株在感染小鼠体内的动态分布，以期为我国刚地弓形虫种群进化研究和弓形虫病的诊断防治提供思路。　　方法：采用PCR-RFLP和DNA序列分析对来源... 详细信息

目的：探明流行我国刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)基因型分布及其对小鼠毒力，观察我国强毒株在感染小鼠体内的动态分布，以期为我国刚地弓形虫种群进化研究和弓形虫病的诊断防治提供思路。
　　方法：采用PCR-RFLP和DNA序列分析对来源于国内不同地域的12株刚地弓形虫以及基因型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型虫株的SAG3基因进行比较分析;弓形虫TgCatwh1、1gCatwh3、TgCatwh6、TgCatys2、TgCatsx1和TgCatgd1速殖子1×103个腹腔感染SPF级KM小鼠，观察小鼠的存活率和死亡时间;同时取TgCatwh3感染小鼠，于感染后第2、4、6、8天，荧光定量PCR方法检测弓形虫在血液、心、肝、脑和淋巴结组织中的动态分布。
　　结果：来源于国内不同地域的12株刚地弓形虫SAG3经PCR-RFLP分型只显示为一种带型，与基因Ⅲ型虫株一致;SAG3基因序列分析显示我国12个弓形虫虫株的NciI酶切位点与国外报道的VEG株一致，同属于基因Ⅲ型，与PCR-RFLP分析结果结果相吻合。除酶切位点外，12个弓形虫株与ToxoDB注册的GT1株及ME49和VEG株进行序列比对分析发现，不同基因型弓形虫株SAG3基因有个别碱基的差异，可能为地理隔离所致的遗传变异。弓形虫TrgCatwh3、TgCatys2、TgCatsx1和TgCatgd株速殖子1×103个腹腔感染KM小鼠，小鼠于5-10天内死亡，腹腔冲洗液涂片可见大量速殖子，为强毒株;弓形虫TgCatwhl和TgCatwh6速殖子经腹腔感染KM小鼠，小鼠只出现一过性的炎症反应，存活小鼠脑组织压片可见大量包囊，为弱毒株。感染后第2天，TgCatwh3虫体即出现在淋巴结和肝组织中，拷贝数分别为2.56±0.097和3.24±0.297，感染后第4天见于血液(4.35±0.507)、心(4.97±0.318)和脑组织(4.89±0.395);血液中虫体随时间推移逐渐增多，第6天时显著增多(P<0.05)，第8天达到高峰(7.75±0.299);心和脑组织中虫体量各时间点之间没有显著性差异(P>0.05)，并以恒定水平持续到实验结束。
　　结论：我国刚地弓形虫具有有限的基因型，即使在相同的基因型内也存在不同毒力的虫株;弓形虫强毒株经腹腔感染KM小鼠，虫体首先侵入腹腔内器官，然后通过血液循环到达全身各器官。

关键词：刚地弓形虫基因型分布毒力分析 DNA序列 SAG3基因

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大鼠CD4~＋CD25-T细胞的Foxp3基因转染及其表达

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中国组织工程研究 2012年第18期16卷 3337-3340页

作者：黄洋李永翔沈继龙罗庆礼陆威霍星星安徽医科大学第一附属医院安徽省合肥市230032 安徽病原生物学省级实验室(安徽医科大学) 人兽共患病安徽省重点实验室(安徽医科大学)安徽省合肥市230032

背景:调节性T细胞在维持机体免疫应答稳态和免疫耐受方面具有非常重要的作用,但外周血中CD4+CD25+调节性T细胞含量极低,且增殖能力较差。目的:以携带Foxp3基因的慢病毒EGFP+载体转染大鼠CD4+CD25-T细胞,观察其在大鼠CD4+CD25-T细胞中的... 详细信息

背景:调节性T细胞在维持机体免疫应答稳态和免疫耐受方面具有非常重要的作用,但外周血中CD4+CD25+调节性T细胞含量极低,且增殖能力较差。目的:以携带Foxp3基因的慢病毒EGFP+载体转染大鼠CD4+CD25-T细胞,观察其在大鼠CD4+CD25-T细胞中的表达。方法:以免疫磁珠两步法分选大鼠CD4+CD25-T细胞,用携带大鼠Foxp3基因的慢病毒载体体外转染分选的细胞,以转染Foxp3基因的CD4+CD25-T细胞为实验组,EGFP空白质粒组及CD4+CD25-T细胞为阴性对照组,CD4+CD25+T细胞为阳性对照组。荧光显微镜和RT-PCR分别从蛋白和mRNA水平检测Foxp3基因的表达。结果与结论:成功完成了免疫磁珠的分选,获得了纯度较高的CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞,细胞存活率为(94±2)%,慢病毒转染的CD4+CD25-T细胞高表达Foxp3基因。表明以携带Foxp3基因的慢病毒载体系统可有效介导Foxp3基因在大鼠CD4+CD25-T细胞中高表达。

关键词：调节性T细胞 CD4+CD25-T细胞慢病毒 Foxp3 磁珠分选

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芍药苷通过IL-13/STAT6信号转导通路抑制成纤维细胞产生胶原

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2011年第2期29卷 93-98页

作者：杜明占沈继龙吴强胡向阳储德勇安徽医科大学病理学教研室合肥230032 安徽医科大学病原生物学教研室安徽病原生物学省级实验室人兽共患病安徽省重点实验室合肥230032

目的观察芍药苷通过白细胞介素13(IL-13)信号转导通路调控3T3成纤维细胞的细胞激活、增殖和胶原产生。方法分别用不同浓度的芍药苷(200、400、600、800和1 000 mg/L)或重组白介素13(rIL-13,6.25、12.5、50、100和200μg/L),在体外刺激... 详细信息

目的观察芍药苷通过白细胞介素13(IL-13)信号转导通路调控3T3成纤维细胞的细胞激活、增殖和胶原产生。方法分别用不同浓度的芍药苷(200、400、600、800和1 000 mg/L)或重组白介素13(rIL-13,6.25、12.5、50、100和200μg/L),在体外刺激经无血清培养基培养12 h的3T3细胞,同时设空白对照组。培养24 h后,用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测rIL-13和芍药苷对细胞增殖的影响,并根据其结果选择1个适宜的rIL-13刺激浓度。用该浓度rIL-13(100μg/L)刺激无血清培养基培养12 h的3T3细胞12 h后,再分别加入不同浓度的芍药苷(200、400、600、800和1 000 mg/L),继续培养24 h,同时设空白对照组。用CCK-8法检测细胞增殖情况,碱裂解法测定培养上清羟脯氨酸含量。蛋白质印迹(Western blotting)分析α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、白介素13受体α1(IL-13Rα1)和信号转导和转录激活因子6(STAT6)的表达情况。RT-PCR检测细胞Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)、IL-13Rα1和STAT6的mRNA水平。结果芍药苷能浓度依赖性地抑制3T3细胞增殖(r=-0.980,P<0.01),且各浓度组间差异有统计学意义(F=198.599,P<0.01)。rIL-13能明显促进3T3细胞增殖(r=0.538,P<0.05)。芍药苷(200、400、600、800和1 000mg/L)能浓度依赖性地抑制rIL-13刺激的3T3细胞增殖(1.780±0.177、1.636±0.073、0.965±0.066、0.623±0.037和0.337±0.022,r=-0.971,P<0.01),且各浓度组间差异有统计学意义(F=198.537,P<0.01)。芍药苷还能浓度依赖性地抑制rIL-13刺激的3T3细胞分泌羟脯氨酸(3.030±0.094、2.976±0.047、2.814±0.047、2.652±0.124和2.408±0.124,r=-0.916,P<0.01),且各浓度组间差异有统计学意义(F=13.642,P<0.01)。Western blotting分析结果显示,芍药苷能抑制rIL-13刺激的3T3细胞α-SMA、IL-13Rα1和STAT6蛋白的表达。RT-PCR结果显示,芍药苷能抑制rIL-13刺激的3T3细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、IL-13Rα1和STAT6 mRNA的转录水平。结论芍药苷通过IL-13/STAT6信号转导通路抑制成纤维细胞增殖、激活和胶原的产生,可能是芍药苷抗日本血吸虫病肝纤维化的机制之一。

关键词：芍药苷成纤维细胞 IL-13 IL-13Rα1 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原

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重组果糖二磷酸醛缩酶SjLAP和亮氨酸氨基肽酶SjFBPA用于日本血吸虫病的诊断和疗效考核的评价(英文)

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2011年第5期29卷 339-347页

作者： Faustina Halm-Lai 罗庆礼钟政荣宋晓蓉陈兆武王林胡梅梅储德勇沈继龙安徽病原生物学省级实验室安徽省人兽共患病重点实验室安徽医科大学病原生物学教研室合肥230022 Cape Coast大学微生物学教研室加纳

目的评价重组亮氨酸氨基肽酶(rSjLAP)和重组果糖二磷酸醛缩酶(rSjFBPA)抗原用于诊断人血吸虫感染以及疗效考核的价值。方法异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导pET-28a-rSjLAP/BL21和pET-28a-rSjFBPA/BL21表达目的蛋白,组氨酸标签亲和... 详细信息

目的评价重组亮氨酸氨基肽酶(rSjLAP)和重组果糖二磷酸醛缩酶(rSjFBPA)抗原用于诊断人血吸虫感染以及疗效考核的价值。方法异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导pET-28a-rSjLAP/BL21和pET-28a-rSjFBPA/BL21表达目的蛋白,组氨酸标签亲和纯化柱纯化rSjLAP和rSjFBPA蛋白。88只BALB/c雌性小鼠随机分为4组,A、B和C组(各21只小鼠),D组(25只小鼠)。A、B和C组分别感染5、15和25条日本血吸虫尾蚴。D组为不感染对照组,在实验的第1天全部处死。A、B和C组在感染后第3、7、10、14、20、30和60天,分别处死小鼠3只,采眼球血制备血清,检测其抗体水平。采用单独或联合rSjLAP和rSjFBPA为抗原,ELISA法检测小鼠血清、急性血吸虫病(38份)和慢性血吸虫病患者(96份)血清中的抗体,以健康人(90份)血清为对照,同时检测华支睾吸虫病(33份)、卫氏并殖吸虫病(40份)和钩虫病患者(37份)血清,并检测急性血吸虫病患者吡喹酮治疗(60 mg/kg,2次/d×2 d)后1年的血清(36份)、慢性血吸虫病患者吡喹酮治疗(剂量,疗程同前)后1年(36份)和2年(64份)的血清。结果 BALB/c小鼠在感染后第10天,rSjLAP和rSjFBPA单独或联合使用均可检测到小鼠血清中的IgG抗体;B组(0.535±0.053,0.595±0.033,0.696±0.104)和C组(0.548±0.060,0.608±0.063,0.621±0.090)早期抗体水平明显高于A组(0.415±0.038,0.455±0.056,0.498±0.077)(P<0.05)。用rSjLAP为抗原可检测急性血吸虫病和慢性血吸虫病患者血清,阳性率分别为97.4%(37/38)和87.5%(84/96)(P>0.05);用rSjFBPA为抗原检测,其阳性率分别为94.7%(36/38)和88.5%(85/96)(P>0.05);用rSjLAP和rSjFBPA联合为抗原检测,则其阳性率分别为94.7%(36/38)和85.4%(82/96)(P>0.05)。rSjLAP或联合抗原的特异性均为96.7%(87/90),而rSjFBPA的特异性为97.8%(88/90)。给予吡喹酮治疗后,rSjLAP和rSjFBPA单独或联合使用检测急性血吸虫病血清(0.236±0.212,0.287±0.191,0.235±0.120)和慢性血吸虫病患者(0.266±0.124,0.261±0.143,0.265±0.140;0.204±0.074,0.176±0.074,0.176±0.073),抗体滴度普遍下降,与对照组(0.188±0.056,0.173±0.045,0.184±0.051)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。rSjLAP和rSjFBPA单独为抗原检测华支睾吸虫病患者血清,交叉反应率为15.2%(5/33)和12.1%(4/33),两者联合则为9.2%(3/33)。rSjLAP检测卫氏并殖吸虫的交叉反应率为15.0%(6/40),rSjFBPA为12.5%(5/40),两种抗原联合检测为15.0%(6/40)。上述抗原单独或联合检测钩虫的交叉反应率均为8.1%(3/37)。上述各组阳性率与健康人群之间差异有统计学意义(P<0.05),显示该重组抗原在其他蠕虫检测中存在一定的交叉反应。结论用rSjFBPA和rSjLAP作为抗原的ELISA法诊断血吸虫病具有良好的敏感性和特异性。

关键词：日本血吸虫病免疫诊断亮氨酸氨基肽酶果糖二磷酸醛缩酶

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芍药苷通过IL-13信号通路抑制日本血吸虫病小鼠肝脏纤维化

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安徽医科大学学报 2011年第4期46卷 314-320页

目的观察芍药苷(PAE)对日本血吸虫感染小鼠肝脏纤维化及白介素13(IL-13)信号转导通路中的IL-13、信号转导蛋白和转录激活子6(STAT6)、白介素-13受体α1(IL-13Rα1)和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)mRNA表达的影响,探讨PAE预防血吸... 详细信息

目的观察芍药苷(PAE)对日本血吸虫感染小鼠肝脏纤维化及白介素13(IL-13)信号转导通路中的IL-13、信号转导蛋白和转录激活子6(STAT6)、白介素-13受体α1(IL-13Rα1)和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)mRNA表达的影响,探讨PAE预防血吸虫病肝纤维化的作用机制。方法 BALB/c小鼠感染血吸虫尾蚴12 d开始,药物组每天灌胃给予PAE[0.2 ml,60 mg/(kg.d)×30 d],正常和模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠,并于感染后第42天起所有各组灌胃给予吡喹酮[500 mg/(kg.d)×2 d]以杀虫。在感染后第8、12周末,分别处死小鼠,取血及肝脏,分别用竞争放射免疫法检测血清透明质酸(HA)含量;碱裂解法测量肝脏羟脯氨酸(HYP)含量;苏木精-伊红(HE)和Masson胶原纤维染色法观察肝虫卵性肉芽肿面积和评价肝纤维化程度;免疫组化染色观察α-平滑肌动蛋白(α-SMA)、IL-13、STAT6、IL-13Rα1的表达情况;RT-PCR检测Col–Ⅰ、Col-ⅢmRNA的表达情况。结果感染后第8、12周时,模型组小鼠血清HA水平和肝脏HYP水平显著高于正常组和药物组(P<0.01);肝脏虫卵肉芽肿面积和纤维化程度显著高于药物组(P<0.01);肝脏α-SMA阳性细胞的表达强度显著高于正常组和药物组(P<0.01);肝脏IL-13表达水平显著高于药物组(P<0.01);肝脏Col-Ⅰ、Col-ⅢmRNA水平显著高于正常组和药物组(P<0.01)。感染后第8周时模型组小鼠STAT6、IL-13Rα1表达水平显著高于药物组(P<0.01)。结论 PAE可能通过抑制IL-13信号转导通路而抑制日本血吸虫病肝纤维化。

关键词：芍药苷血吸虫日本肝硬化白细胞介素13

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日本血吸虫感染鼠巨噬细胞IL-13Rα2的表达

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中国人兽共患病学报 2011年第7期27卷 597-600,609页

作者：王维郑胜生祁瑶闻惠琴刘丽丽沈继龙安徽医科大学病原生物学教研室人畜共患病安徽省重点实验室合肥230032

目的检测IL-13的诱骗受体IL-13Rα2在血吸虫病巨噬细胞的表达,为从细胞水平探讨Th2型免疫性疾病分子病理机制奠定基础。方法建立日本血吸虫病鼠模型,采用免疫荧光标记法分别检测肝肉芽肿和原代巨噬细胞IL-13Rα2蛋白的表达情况。结果荧... 详细信息

目的检测IL-13的诱骗受体IL-13Rα2在血吸虫病巨噬细胞的表达,为从细胞水平探讨Th2型免疫性疾病分子病理机制奠定基础。方法建立日本血吸虫病鼠模型,采用免疫荧光标记法分别检测肝肉芽肿和原代巨噬细胞IL-13Rα2蛋白的表达情况。结果荧光显微镜下观察:肝肉芽肿内可见似"咖啡豆样"散在分布的IL-13Rα2免疫阳性信号,巨噬细胞膜内缘呈异常增强的环状荧光。结论巨噬细胞是IL-13Rα2阳性表达细胞,IL-13Rα2是血吸虫病重要的免疫病理调节分子。

关键词：血吸虫病肉芽肿巨噬细胞 IL-13Rα2 CD68 免疫荧光染色技术

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IgY-和IgG-ELISA用于日本血吸虫病循环抗原检测的效果比较

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中华预防医学杂志 2011年第9期45卷 859-860页

作者：周银娣温和汪六庆沈继龙合肥市第一人民医院检验科安徽省230032 徐州医学院病原生物学教研室安徽医科大学病原生物学教研室人畜共患病安徽省重点实验室

目前，血吸虫病循环抗原的检测敏感度和特异度均不理想，交叉反应有待解决[1]。免疫检测体系中，探针的特异度和亲和力是影响检测效果的主要因素。IgY是卵黄免疫球蛋白的简称，是用特异性抗原免疫产蛋母鸡后母鸡血液中的抗体转移到蛋黄... 详细信息

目前，血吸虫病循环抗原的检测敏感度和特异度均不理想，交叉反应有待解决[1]。免疫检测体系中，探针的特异度和亲和力是影响检测效果的主要因素。IgY是卵黄免疫球蛋白的简称，是用特异性抗原免疫产蛋母鸡后母鸡血液中的抗体转移到蛋黄中去的，且是蛋黄中惟一存在的抗体，和哺乳动物的IgG相比，IgY具有高特异、高灵敏度，

关键词： IgG-ELISA 循环抗原检测日本血吸虫病卵黄免疫球蛋白特异度交叉反应抗原免疫哺乳动物

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芍药苷对感染血吸虫小鼠肝纤维化的影响

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中国人兽共患病学报 2010年第2期26卷 115-119页

作者：闻慧琴沈继龙罗庆礼李小月安徽病原生物学省级实验室(安徽医科大学) 安徽医科大学病原生物学教研室人兽共患病安徽省重点实验室(安徽医科大学) 合肥230032

目的探讨小鼠感染日本血吸虫后经吡喹酮治疗的不同时期,给予芍药苷对肝组织虫卵肉芽肿和纤维化的影响。方法以日本血吸虫尾蚴感染BALB/c小鼠构建肝纤维化模型,随机分为(Ⅰ)杀虫前给药组、(Ⅱ)杀虫同时给药组及(Ⅲ)杀虫后给药组。除正常... 详细信息

目的探讨小鼠感染日本血吸虫后经吡喹酮治疗的不同时期,给予芍药苷对肝组织虫卵肉芽肿和纤维化的影响。方法以日本血吸虫尾蚴感染BALB/c小鼠构建肝纤维化模型,随机分为(Ⅰ)杀虫前给药组、(Ⅱ)杀虫同时给药组及(Ⅲ)杀虫后给药组。除正常组外,杀虫治疗、芍药苷治疗组和对照组小鼠分别于感染后12d、42d和72d给予芍药苷和对照,并于102d、132d和162d处死。检测透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢP)、羟脯氨酸(Hyp)、虫卵肉芽肿大小、肝纤维化分级以及胶原Ⅰ的表达。结果在组Ⅰ和组Ⅲ,芍药苷明显降低血清中HA、PⅢP和肝组织中Hyp的含量,减小虫卵结节并降低肝纤维化严重程度分级,降低胶原Ⅰ的表达(P<0.05或P<0.01);在组Ⅱ,大部分指标没有明显差别(P>0.05)。结论芍药苷无论是早期或延后给药,都具有抑制虫卵肉芽肿,减少胶原的生成从而对抗小鼠血吸虫性肝纤维化的作用。

关键词：芍药苷日本血吸虫病肝纤维化胶原Ⅰ

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敏感性PCR检测猪肉弓形虫方法的建立与应用

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中国人兽共患病学报 2010年第10期26卷 895-899页

作者：余莉朱新伊胡元生张俊玲罗庆礼沈继龙安徽医科大学病原生物学教研室人兽共患病安徽省重点实验室合肥230032 安徽医科大学第三附属医院检验科合肥230031

目的建立一种敏感快速的猪肉弓形虫PCR检测方法,并用来检测市售猪肉弓形虫的感染情况。方法采用不同数量的弓形虫模拟感染猪肉样本,分别以529 bp重复序列、B1基因、SAG1、SAG2、SAG3作为目标检测基因,对其敏感性进行评价,在此基础上运... 详细信息

目的建立一种敏感快速的猪肉弓形虫PCR检测方法,并用来检测市售猪肉弓形虫的感染情况。方法采用不同数量的弓形虫模拟感染猪肉样本,分别以529 bp重复序列、B1基因、SAG1、SAG2、SAG3作为目标检测基因,对其敏感性进行评价,在此基础上运用敏感的靶标检测100份市售猪肉样本中弓形虫的感染情况。结果 529 bp重复序列的敏感性最高,用此靶标检测合肥市售猪肉,弓形虫阳性率为17%。结论 529 bp重复序列基因是一个可用于肉制品中弓形虫PCR检测的理想靶标。

关键词：弓形虫 PCR 猪肉

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