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作者：李源玲蔡亦红 Faustina Poppoe 沈继龙安徽病原生物学省级实验室人兽共患病安徽省重点实验室(安徽医科大学)安徽医科大学病原生物学教研室安徽医科大学公共卫生学院检验教研室

目的:探讨弓形虫效应分子GRA15诱导的caMφ逆转小鼠肝癌微环境中的TAMs从M2向M1极化,抑制肿瘤增殖、侵袭及转移,旨在为肿瘤免疫治疗提供新思路和新策略。方法:从Ⅱ型弓形虫PRU株中提取总RNA,扩增多态性GRA15编码基因,构建重组质粒pegfp-... 详细信息

目的:探讨弓形虫效应分子GRA15诱导的caMφ逆转小鼠肝癌微环境中的TAMs从M2向M1极化,抑制肿瘤增殖、侵袭及转移,旨在为肿瘤免疫治疗提供新思路和新策略。方法:从Ⅱ型弓形虫PRU株中提取总RNA,扩增多态性GRA15编码基因,构建重组质粒pegfp-gra15Ⅱ。体外将质粒亚克隆入慢病毒载体并感染小鼠细胞系RAW264.7,使之诱导为ca Mφ。体外分别将Lv-gra15Ⅱ-Mφ（A组）,空白病毒载体Lv-Mφ（B组）和未感染Mφ（C组）与小鼠肝癌细胞系Hepa1-6进行transwell共培养,观察上述三组Hepa1-6的增殖、迁移和侵袭能力,以及MMP-9和MMP-2表达。体内实验,取75只SPF级4-5w龄雌性C57/BL6小鼠,右腹股沟皮下成瘤。3d后随机分为3组,每组25只。A组为在皮下注射成瘤后3d、5d分别尾静脉给予重悬于150μl生理盐水的2×106 Lv-gra15Ⅱ-Mφ;B组给予重悬于150μl生理盐水的2×106 Lv-Mφ;C组给予150μl生理盐水。在皮下注射成瘤10d后无痛处死小鼠。剥离肿瘤组织,观察实体瘤体积;免疫组化检测肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）浸润和免疫抑制因子及血管生成相关因子的表达;瘤体q RT-PCR检测iN OS、TGF-β、VEGF、IL-6和IL-10表达;ELISA检测IL-6水平的变化。结果:***15可驱动RAW264.7向ca Mφ方向极化。FCM、细胞培养上清和q RT-PCR检测均显示Lv-gra15Ⅱ-Mφ相比于Lv-Mφ和Mφ,其PD-L1,CD80,NO、TNF-α,IL-12p40和iN OS有显著升高（P<0.05）。2.体外共培养实验显示,Lv-gra15Ⅱ-Mφ可抑制小鼠肝癌细胞Hepa1-6迁移、侵袭,可下调其外基质相关蛋白的分泌,而对Hepa1-6凋亡无影响。q RT-PCR和蛋白水平检测均显示A组与B组和C组比较,MMP-9、MMP-2表达显著下调（P<0.05）。3.体内试验TAMs检测结果,Lv-gra15Ⅱ-Mφ可减轻TAMs浸润,并且使其向M1方向偏移,抑制肿瘤的增生。实体瘤免疫组化分析显示,A组TAMs浸润显著减少（P<0.05）,IL-10,TGF-β及血管内皮生长因子（VEGF）表达下调,而MHC Ⅱ增加。q RT-PCR检测显示A组实体瘤中iN OS表达明显增加（P<0.05）,而TGF-β、VEGF、IL-6和IL-10表达抑制。ELISA检测显示A组瘤体内的IL-6分泌下调（P<0.05）。结论:弓形虫效应分子GRA15慢病毒感染RAW264.7,可驱动后者向caMφ极化,且GRA15在宿主细胞内可稳定、持续表达。在肿瘤发生早期被动输入虫源性GRA15驱动的ca Mφ可通过调节TAMs的浸润和偏移明显抑制肿瘤在体内的进展。GRA15对宿主无明显毒副作用,具有深入研究的应用价值。

关键词：弓形虫致密颗粒蛋白GRA15 肝细胞性肝癌 TAMs

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七年制医学生早期科研能力训练的探讨

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成都中医药大学学报（教育科学版） 2017年第1期19卷 9-11页

作者：侯昕刘淼计永胜任翠平沈际佳安徽医科大学基础医学院/安徽病原生物学省级实验室安徽合肥230032

现代医学的发展要求培养兼备临床综合知识和科学研究能力的高层次医学人才。然而,目前高等医学教育工作中,临床医学生的科研能力培养并未得到应有的重视。结合安徽医科大学实际,详细解析在基础医学阶段,对七年制医学生进行早期科研训练... 详细信息

现代医学的发展要求培养兼备临床综合知识和科学研究能力的高层次医学人才。然而,目前高等医学教育工作中,临床医学生的科研能力培养并未得到应有的重视。结合安徽医科大学实际,详细解析在基础医学阶段,对七年制医学生进行早期科研训练的有效途径和存在的问题。

关键词：七年制医学生科研能力有效途径

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不同毒力弓形虫感染对孕期小鼠巨噬细胞的极化及胎盘滋养细胞凋亡的影响

不同毒力弓形虫感染对孕期小鼠巨噬细胞的极化及胎盘滋养细胞凋亡...

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2012年安徽省医学会微生物与免疫学、热带病与寄生虫病学会换届改选与学术研讨会

作者：刘婷婷蔡亦红李敏余莉都建汪学龙罗庆礼沈继龙张倩刘丽丽徐修才陈鹤王花孔兰婷王为为张爱梅安徽医科大学病原生物学教研室安徽省病原生物学实验室安徽省人兽共患病重点实验室

目的：本文研究了流行于我国的Chinese Ⅰ型弓形虫感染孕中期小鼠后，小鼠巨噬细胞的极化改变及所导致的Th1/Th2偏移，以及对胎盘滋养层细胞凋亡带来的影响。　　方法：体内试验：ICR小鼠90只于妊娠第8天随机分别腹腔注射Chinese Ⅰ型或... 详细信息

目的：本文研究了流行于我国的Chinese Ⅰ型弓形虫感染孕中期小鼠后，小鼠巨噬细胞的极化改变及所导致的Th1/Th2偏移，以及对胎盘滋养层细胞凋亡带来的影响。
　　方法：体内试验：ICR小鼠90只于妊娠第8天随机分别腹腔注射Chinese Ⅰ型或Chinese Ⅱ型弓形虫速殖子200个0.1ml各30只，另外30只注射等量的无菌PBS做对照。分别于妊娠第10、12、14、16、18天颈椎脱臼处死小鼠，取腹腔巨噬细胞和胎盘。部分胎盘匀浆上清和巨噬细胞3h贴壁换液培养24h后的上清测Th1/Th2细胞因子，部分胎盘和巨噬细胞提RNA荧光定量PCR测iNOs、TNF-α、IFN-γ、Fizzi、Yml、Arg-1、IL-4、IL-10、IL-12p40。巨噬细胞蛋白用Westem-blotting验证iNOs和Arg-1。部分胎盘4％甲醛固定石蜡包埋HE染色和TUNEL。部分胎盘用流式Annexin V-EGFP测凋亡。巨噬细胞用流式抗体标记测M1、M2极化情况。巨噬细胞上清测尿素和NO。体外实验：孕鼠于孕1214天无菌操作取胎盘滋养层细胞和巨噬细胞Transwell共培养，速殖子与巨噬细胞1：1分别感染Chinese I型和Chinese II型虫株，设一组不加速殖子做对照.分别于2h, 6h, 12h. 24h收集上清和巨噬细胞，滋养层细胞做流式Annexin V-EGFP测凋亡和固定做TUNEL。巨噬细胞的上清、RNA、蛋白检测同体内实验。
　　结果：三组胎盘随着妊娠天数的增加凋亡率都上升，但同时间相比，Chinese I型组凋亡率高于Chinese II型，Chinese II型又高于对照组。Chinese II型虫株感染的小鼠腹腔巨噬细胞在孕14天开始出现高水平的NO，孕16天达高峰，孕18天消退：其他两组无NO产出。体外实验中，2h, 6h. 12h.24h的巨噬细胞上清中，Chinese I型感染的各时间点上清都出现高水平的尿素，即精氨酸酶的活性高，而Chinese II型感染的上清则比对照组稍高一点点。
　　结论：Chinese I型虫株感染后，孕鼠巨噬细胞向M2型极化，致体内免疫偏向Th2型，使得弓形虫速殖子大量繁殖，破坏宿主细胞，各种原因(营养供应或生存的稳态环境遭破坏)滋养层细胞凋亡增加;而ChineseII型感染后，孕鼠巨噬细胞向M1型极化，致体内免疫偏向Thl型，原先的妊娠Th2型的环境被迫转向Thl型，大量炎症介质产生，机体变得不耐受，也使滋养层细胞凋亡增加。

关键词：弓形虫巨噬细胞胎盘滋养层细胞凋亡孕期感染

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FasL反义寡核苷酸对舌鳞癌细胞Tca8113增殖和凋亡的影响

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安徽医科大学学报 2012年第11期47卷 1300-1303页

作者：方丽陈乔尔任翠平沈际佳安徽医科大学口腔医学院安徽医科大学附属口腔医院安徽省口腔临床医学重点学科安徽省口腔疾病研究省级实验室中央与地方共建口腔医学中心实验室合肥230032 安徽医科大学病原生物学教研室合肥230032

目的探讨Fas配体(FasL)反义寡核苷酸(ASO)对舌鳞癌细胞系Tca8113细胞增殖和凋亡的影响。方法设计合成特异性的FasL ASO,并用阳离子脂质体介导转染Tca8113细胞。荧光倒置显微镜观察及流式细胞术(FCM)检测转然前后的转染效率,四甲基偶氮唑... 详细信息

目的探讨Fas配体(FasL)反义寡核苷酸(ASO)对舌鳞癌细胞系Tca8113细胞增殖和凋亡的影响。方法设计合成特异性的FasL ASO,并用阳离子脂质体介导转染Tca8113细胞。荧光倒置显微镜观察及流式细胞术(FCM)检测转然前后的转染效率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度ASO在转染后不同时间对Tca8113细胞增殖的影响;FCM测定转染前后诱导Tca8113细胞的凋亡情况。结果通过荧光倒置显微镜观察及FCM检测发现在脂质体的量一定的情况下,在一定范围内,ASO的浓度越高,转染效率越高。MTT结果显示ASO对Tca8113细胞的增殖有明显抑制作用(P<0.05),FCM对细胞凋亡的检测结果显示反义链组与正义链组、空白对照组及脂质体组相比,总凋亡率有明显差异(P<0.05)。结论 FasL ASO对Tca8113细胞的增殖有一定的抑制作用,能够促进其凋亡,因此FasL ASO有望成为舌鳞癌的潜在的基因治疗方法。

关键词： Fas Fas配体反义寡核苷酸技术舌鳞癌细胞

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弓形虫病的若干术语释义及实验室诊断的临床意义

弓形虫病的若干术语释义及实验室诊断的临床意义

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第九届北京热带医学与寄生虫学论坛

作者：沈继龙安徽医科大学病原生物学教研室安徽省病原生物学实验室安徽省人兽共患病重点实验室

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弓形虫抑制巨噬细胞凋亡的STAT3-miR-17~92-Bim新信号通路

弓形虫抑制巨噬细胞凋亡的STAT3-miR-17~92-Bim新信号通路

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中国动物学会原生动物学分会第十七次学术讨论会

作者：蔡亦红张爱梅李敏闻慧琴陈鹤罗庆礼沈继龙安徽医科大学病原生物学教研室安徽省病原生物学省级实验室安徽省人兽共患病重点实验室合肥 230032

弓形虫是广泛寄生于温血动物体内的专性细胞内寄生原虫.原虫在寄生生活演化过程中获得了抑制细胞凋亡的机制,以利自身的细胞内增殖, 同时也导致虫体的全身播散和迁延.宿主蛋白定量分析显示,弓形虫不同感染阶段宿主细胞蛋白表达谱不同,...

弓形虫是广泛寄生于温血动物体内的专性细胞内寄生原虫.原虫在寄生生活演化过程中获得了抑制细胞凋亡的机制,以利自身的细胞内增殖, 同时也导致虫体的全身播散和迁延.宿主蛋白定量分析显示,弓形虫不同感染阶段宿主细胞蛋白表达谱不同,但其机制不明.miRNA具有物种特异性,可以通过特异性结合mRNA,下调蛋白质的翻译.

关键词：

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安徽省市售猪肉弓形虫感染阳性率及基因分型的研究

安徽省市售猪肉弓形虫感染阳性率及基因分型的研究

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2012年安徽省医学会微生物与免疫学、热带病与寄生虫病学会换届改选与学术研讨会

作者：王花王腾霍星星王林罗庆礼刘婷婷徐修才余莉沈继龙安徽医科大学病原生物学教研室安徽省病原生物学实验室安徽省人兽共患病重点实验室

为了评估人在摄入猪肉这一中国最普遍的肉制品后弓形虫传播给人的风险并确定其主要基因型，本文从安徽省四个地区的零售肉摊购买新鲜猪瘦肉样本416份，其中合肥101份，肥东100份，肥西114份，长丰101份。每个样本通过荧光定量PCR检测组... 详细信息

为了评估人在摄入猪肉这一中国最普遍的肉制品后弓形虫传播给人的风险并确定其主要基因型，本文从安徽省四个地区的零售肉摊购买新鲜猪瘦肉样本416份，其中合肥101份，肥东100份，肥西114份，长丰101份。每个样本通过荧光定量PCR检测组织样本中弓形虫DNA及ELISA检测组织液中抗弓形虫抗体。14个组织液ELISA和荧光定量PCR同时阳性的组织接种小鼠分离虫株。最后获得1个分离株，为了观察这株的毒力，10只6周龄的小雌鼠，每只小鼠腹腔注射1000个速殖子。逐日观察并记录小鼠的死亡情况。为了确定这一猪肉中分离的弓形虫基因型，对1个分离株和7个具有较高弓形虫浓度的阳性DNA样本使用9个基因位点SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, L358, PK1, c22-8, c29-2和Apico的PCR-RFLP方法进行分型。
　　结果：416份样本中ELISA阳性的有一42个，阳性率为10.1%：荧光定量PCR阳性有75个，阳性率为18.03%0 14个荧光定量PCR和ELISA同时阳性的样本接种小鼠后分离到一个虫株((Tgpkix 171)，腹腔接种10只小鼠均在5-10天内死亡，提示该分离株为强毒株。在PCR-RFLP的分型结果中只有分离株和两个阳性DNA样本在所有位点具有完整数据。分离株(Tgpkfxl7l)属于ToxoDB#9(基因型Chinese 1)。两个阳性的DNA样本(Tgpkhf2和Tgpkhf3)属于ToxoDB#213，该基因型为首次报道。另外5个阳性DNA样本只能在部分位点被分型。
　　结论：安徽省市售猪肉弓形虫感染PCR阳性率为10.1%，同时从猪肉中分离到活的弓形虫，提示人在摄入未经检验检疫的未熟猪肉后有感染弓形虫的风险;ToxoDB#9 (Chinese 1)和ToxoDB#213基因型可能是这一区域猪肉中弓形虫的主要基因型。

关键词：猪肉弓形虫感染阳性率基因分型传播风险荧光定量PCR技术

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siRNA干扰嘌呤补救合成途径的关键酶对弓形虫增殖的抑制作用

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中国人兽共患病学报 2009年第1期25卷 9-12,16页

作者：余莉李霞郜玉峰罗庆礼乔增培沈继龙安徽医科大学病原生物学教研室人兽共患病安徽省重点实验室教育部省部共建重点实验室合肥230032 安徽中医学院第二附属医院合肥230061 安徽医科大学第一附属医院感染病科合肥230032

目的探讨siRNA同时干扰嘌呤补救合成途径中两个关键酶对弓形虫增殖速率的影响。方法将针对腺苷激酶(AK)和次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)的siRNA同时电转染弓形虫,然后将弓形虫接种人包皮成纤维细胞(HFF),24h和40h后Gie... 详细信息

目的探讨siRNA同时干扰嘌呤补救合成途径中两个关键酶对弓形虫增殖速率的影响。方法将针对腺苷激酶(AK)和次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)的siRNA同时电转染弓形虫,然后将弓形虫接种人包皮成纤维细胞(HFF),24h和40h后Giemsa染色,光镜下计数假包囊内弓形虫速殖子数目,计算弓形虫平均倍增次数。同时将弓形虫进行模拟电转,接种HFF细胞后,不加磺胺嘧啶进行培养作为阴性对照,加入10μg/mL磺胺嘧啶培养作为阳性对照。结果在接种HFF细胞后24h,4μmol/L的AK siRNA786和HXGPRT siRNA415联合电转弓形虫、阳性对照组及阴性对照组弓形虫的平均倍增次数分别为:1.64±0.95、1.04±0.88及2.32±0.90,前两组与后者相比倍增次数明显减少(P<0.05)。在接种后40h,siRNA联合电转弓形虫与阳性对照组弓形虫的平均倍增次数分别为3.00±1.04,2.56±1.04,与阴性对照组相比(3.60±0.80)差异有显著性(P<0.05)。结论嘌呤补救合成途径中的两个关键酶-AK和HXGPRT被其siRNA同时抑制后,弓形虫在细胞内的增殖速率显著减缓。

关键词：弓形虫嘌呤代谢腺苷激酶次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 RNA干扰 siRNA

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基于IgY的ELISA用于日本血吸虫病循环抗原的检测

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安徽医科大学学报 2008年第4期43卷 372-376页

作者：周银娣罗庆礼余轶婧张诗海李静沈继龙安徽医科大学病原生物学教研室人畜共患病安徽省重点实验室重要遗传病基因资源利用教育部省部共建重点实验室合肥230032

目的以鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)替代哺乳动物来源的IgG抗体,建立双抗体夹心ELISA用于日本血吸虫病的诊断。方法制备并纯化抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的卵黄抗体IgY和抗SEA的兔多克隆IgG抗体;以抗SEA的IgG为捕获抗体,IgY为检测抗体... 详细信息

目的以鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)替代哺乳动物来源的IgG抗体,建立双抗体夹心ELISA用于日本血吸虫病的诊断。方法制备并纯化抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的卵黄抗体IgY和抗SEA的兔多克隆IgG抗体;以抗SEA的IgG为捕获抗体,IgY为检测抗体的双抗体夹心ELISA诊断方法,共检测血清443份,其中急性血吸虫病患者血清68例,慢性血吸虫病患者180例,正常人100例,肺吸虫感染者20例,华支睾吸虫感染者48例和钩虫感染者血清27例。探讨基于IgY的循环抗原检测的应用价值。结果成功制备并鉴定了特异性IgY和IgG抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测体系;检测急性血吸虫病患者和慢性血吸虫病患者血清的阳性率分别为79.4%和64.4%,最低灵敏度为9.3μg/L;正常人血清的阴性率为92%;与肺吸虫、华支睾吸虫、钩虫感染者血清的交叉反应分别为20%、20.8%、14.8%。结论建立了基于IgY的双抗夹心ELISA检测体系,用于日本血吸虫SEA的检测具有一定特异性和较高的敏感性,可试用于日本血吸虫病的辅助诊断。

关键词：血吸虫病日本/诊断

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血清透明质酸和层粘蛋白检测在日本血吸虫性肝纤维化程度判断的作用

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安徽医科大学学报 2008年第2期43卷 225-226页

作者：贾中伟罗庆礼陆琼沈继龙安徽医科大学第一附属医院检验科合肥230022 人畜共患病安徽省重点实验室教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室安徽医科大学安徽医科大学病原生物学教研室合肥230032

目的观察晚期日本血吸虫患者血清中透明质酸(HA)与层粘蛋白(LN)水平,探讨HA与LN在日本血吸虫性肝纤维化中诊断价值。方法358例晚期血吸虫患者,采用B超对肝纤维化程度进行分级。随机选取HBsAg阴性的早期肝纤维化患者39例、晚期肝纤维化患... 详细信息

目的观察晚期日本血吸虫患者血清中透明质酸(HA)与层粘蛋白(LN)水平,探讨HA与LN在日本血吸虫性肝纤维化中诊断价值。方法358例晚期血吸虫患者,采用B超对肝纤维化程度进行分级。随机选取HBsAg阴性的早期肝纤维化患者39例、晚期肝纤维化患者29例,检测患者血清HA与LN水平。结果日本血吸虫性晚期肝纤维化患者血清HA与LN水平分别为(273.42±216.54)g/L、(152.48±43.32)g/L,其浓度显著高于早期肝纤维化组(P<0.01)和正常对照组(P<0.01)。早期肝纤维化患者血清HA与LN水平分别为(48.88±30.96)g/L、(125.05±19.72)g/L,与正常对照组差异无显著性(P>0.05)。结论在日本血吸虫性肝纤维化患者中,血清HA与LN水平不能作为肝纤维化的早期实验室诊断指标,但是可以作为肝纤维化发展的重要标志物。

关键词：透明质酸层粘连蛋白血吸虫病日本肝硬化

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