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2012‘中国生物药物创新研究论坛

作者：武玉永谭秀华马立新滨州医学院遗传学教研室山东烟台264003 湖北大学生命科学学院分子微生物学与基因工程实验室湖北武汉430062

目的：构建土壤基因组文库,通过功能筛选得到一水解底物魔芋粉的阳性克隆,测序后,序列分析表明:该基因全长为1530bp,包含一个糖基水解家族26结构域,编码510个氨基酸,相对分子质量为56,438.方法：此基因推导的氨基酸序列与Cellulomonas f... 详细信息

目的：构建土壤基因组文库,通过功能筛选得到一水解底物魔芋粉的阳性克隆,测序后,序列分析表明:该基因全长为1530bp,包含一个糖基水解家族26结构域,编码510个氨基酸,相对分子质量为56,438.方法：此基因推导的氨基酸序列与Cellulomonas fimi的Man26A和Cellvibrio japonicus的mannanaseA氨基酸序列同源性分别为64.3％、38％.将此基因的成熟肽的编码序列克隆到表达载体pHBM905上,得到重组质粒pHBM730,将pHBM730经SalI酶切线性化后转化三株毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168,该甘露聚糖酶基因在这三种毕赤酵母中均实现分泌表达.将此三种重组毕赤酵母GS115 (pHBM730)、KM71 (pHBM730)、SMD1168 (pHBM730)诱导产酶,对这三种重组酶进行相关的酶学性质研究.结果：分析表明,在KM71中表达量最高,其最适反应pH值均约为6.6,最适反应温度均约为45℃.在最适反应条件下测得其酶活力为19.64U.结论：为瓜尔豆胶降解产物的工业化应用提供了参考.

关键词：甘露聚糖酶基因分子克隆毕赤酵母表达载体酶学性质

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鼻咽癌病人放疗前后VCA-IgA抗体及EB病毒DNA水平变化

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齐鲁医学杂志 2012年第4期27卷 283-285,288页

作者：聂亚红孙迎娟阎丽平刘成玉罗兵青岛大学医学院微生物学教研室山东青岛266021 青岛大学医学院附属医院感染管理科青岛市中心医院检验科青岛大学医学院诊断学教研室

目的检测鼻咽癌病人放疗前、放疗1个疗程及放疗结束后血清EB病毒衣壳抗原IgA(VCA-IgA)抗体水平及EB病毒DNA(EBV DNA)载量的变化,探讨其在鼻咽癌疗效监测及预后评估中的价值。方法收集EBV阳性鼻咽癌病人放疗前、放疗1个疗程及放疗结束后... 详细信息

目的检测鼻咽癌病人放疗前、放疗1个疗程及放疗结束后血清EB病毒衣壳抗原IgA(VCA-IgA)抗体水平及EB病毒DNA(EBV DNA)载量的变化,探讨其在鼻咽癌疗效监测及预后评估中的价值。方法收集EBV阳性鼻咽癌病人放疗前、放疗1个疗程及放疗结束后的血清标本,提取外周血细胞DNA。应用ELISA试剂盒检测血清VCA-IgA抗体水平的变化,实时荧光定量PCR方法检测EBV DNA载量的变化。结果 22例鼻咽癌病人3个不同放疗阶段血清VCA-IgA抗体和EBV DNA水平比较差异均有显著性(F=3.305、9.461,P<0.05)。放疗结束后VCA-IgA抗体水平显著低于放疗前水平(t=2.081,P<0.05),而放疗1个疗程后与放疗前及放疗结束后相比差异均无显著性(P>0.05)。7例病人从治疗开始至治疗结束均未检测到EBV DNA,其余15例病人EBV DNA载量放疗前与放疗1个疗程及放疗结束后相比差异均有显著性(t=2.47、4.34,P<0.05),而放疗1个疗程和放疗结束后相比差异无显著性(P>0.05)。结论同时检测血清中EBV抗体及EBV DNA水平有助于鼻咽癌疗效监测及预后评估。

关键词：鼻咽肿瘤疱疹病毒4型,人 VCA-IgA抗体 EB病毒DNA

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EB病毒早期基因BHRF1转基因小鼠纯合子建立及建系

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青岛大学医学院学报 2012年第4期48卷 343-345页

作者：吴国才王笑峰胡顺霞李欣罗兵青岛大学医学院微生物学教研室山东青岛266021 上海市松江区疾病预防控制中心

目的构建整合有EB病毒(EBV)早期基因BamHI-H右向读码框1(BHRF1)基因纯合子转基因小鼠。方法通过显微注射技术构建BHRF1阳性首建鼠F0共16只,将转基因小鼠与正常小鼠交配,得到子代F1小鼠,PCR技术检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性鼠... 详细信息

目的构建整合有EB病毒(EBV)早期基因BamHI-H右向读码框1(BHRF1)基因纯合子转基因小鼠。方法通过显微注射技术构建BHRF1阳性首建鼠F0共16只,将转基因小鼠与正常小鼠交配,得到子代F1小鼠,PCR技术检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性鼠。阳性鼠再与同系阴性鼠杂交得到F2小鼠,筛选出F2小鼠中的阳性鼠近交得F3小鼠。筛选出F3小鼠中的纯阳性鼠进行近交,得到纯阳性F4小鼠。F4小鼠再近交得到纯阳性F5小鼠。结果经PCR及测序证实,F4、F5小鼠均为BHRF1阳性鼠,测序结果经blast比对,与BHRF1基因完全相同。结论本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型,并成功筛选出纯阳性BHRF1转基因小鼠,为深入研究BHRF1的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型。

关键词：疱疹病毒4型,人早期基因BHRF1 小鼠,转基因

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骨髓间充质干细胞上清液对大鼠佐剂性关节炎防治作用的实验研究

骨髓间充质干细胞上清液对大鼠佐剂性关节炎防治作用的实验研究

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2012环境健康与药物安全性全国学术年会

作者：许键炜何志旭申长清赵芳芳贵阳医学院药理学教研室贵州贵阳 550004 贵阳医学院组织工程与干细胞实验中心贵阳医学院附属医院儿科贵州贵阳 550004 济宁医学院附属医院儿科山东济宁 272000 蚌埠医学院微生物学教研室安徽蚌埠 233000

目的：探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)上清液对大鼠佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis,AA)的治疗、干预作用。　　方法：体外分离、培养并纯化、鉴定SD大鼠骨髓MSCs,收集培养MSCs 48小时的上清培养液.将健康雄性SD... 详细信息

目的：探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)上清液对大鼠佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis,AA)的治疗、干预作用。
　　方法：体外分离、培养并纯化、鉴定SD大鼠骨髓MSCs,收集培养MSCs 48小时的上清培养液.将健康雄性SD大鼠随机分为5组：正常对照组、模型组、L-DMEM培养液对照组、MSCs上清液治疗组和MSCs上清液干预组.造模组大鼠右后足跖皮内一次性注射弗氏完全佐剂0.1ml/只.造模成功后行MSCs上清液治疗及干预.造模后1、7、14、21和28天测量大鼠体重、踝关节周长和后足爪体积,同时观察大鼠生存状况。治疗后第21天,行四肢关节X光片检查及病理检查.
　　结果：佐剂性关节炎模型大鼠用MSCs上清液治疗后关节肿胀明显减轻,四肢X线显示骨性关节面光滑,关节边缘骨质破坏明显修复,关节间隙出现.踝关节常规病理HE染色见关节滑膜病变和炎性细胞浸润明显减少,组织水肿减轻.造模干预组经MSCs上清液治疗,原发性炎症和继发病变均不明显,关节X线和病理检查均未见明显异常,体重增长良好,毛色光亮,各数值接近正常对照组,与佐剂性关节炎模型组大鼠相比,体重、足爪体积以及踝关节周长差异有统计学意义(P＜0.05).而造模L-DMEM培养液对照组,各参数与佐剂性关节炎组大鼠相比差异无明显统计学意义。
　　结论：MSCs上清液治疗可有效减轻AA大鼠的关节肿胀,并能有效干预AA的发生.其作用机制可能为MSCs上清液中存在MSCs分泌的可溶性细胞因子,具体成分还有待进一步研究.

关键词：骨髓间充质干细胞上清液佐剂性关节炎临床治疗干预作用

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侵袭性牙周炎与慢性牙周炎病变位点中人巨细胞病毒的定量检测

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华西口腔医学杂志 2011年第3期29卷 242-245页

作者：李潇孙钦峰孙允东葛少华杨丕山山东大学口腔医院牙周科山东省口腔生物医学重点实验室山东大学医学院医学微生物学教研室济南250012

目的应用实时荧光定量PCR方法检测侵袭性牙周炎(AgP)及慢性牙周炎(CP)患者龈下样本中人巨细胞病毒(HCMV)的DNA载量,探讨HCMV感染与牙周炎之间的关系。方法选择18例AgP患者、24例CP患者及15例牙周健康对照者,收集龈下样本114例。构建含有... 详细信息

目的应用实时荧光定量PCR方法检测侵袭性牙周炎(AgP)及慢性牙周炎(CP)患者龈下样本中人巨细胞病毒(HCMV)的DNA载量,探讨HCMV感染与牙周炎之间的关系。方法选择18例AgP患者、24例CP患者及15例牙周健康对照者,收集龈下样本114例。构建含有HCMV高保守片段的重组质粒,制备标准品DNA模板,建立并应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,检测样本中HCMV的DNA载量。结果 AgP病变位点、CP病变位点以及牙周健康位点中HCMV的阳性检出率分别为58.3%、41.7%和6.7%。AgP和CP病变位点中HCMV的阳性检出率显著高于牙周健康位点(P<0.01)。在AgP病变位点中,病毒载量在104以上的位点占33.3%,明显高于CP病变位点的10.4%,两组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 HCMV感染与牙周炎的发生发展密切相关,其活动性感染可能与AgP组织破坏的迅速进展有关。

关键词：人巨细胞病毒侵袭性牙周炎慢性牙周炎

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循环DNA和HBV-DNA载量与原发性肝癌的相关性探讨

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现代生物医学进展 2011年第19期11卷 3713-3715页

作者：张雪峰王斌钱冬萌吴宝叶石海英刘淑清闫安高红梅闫丽娟康燕李宝华青岛大学医学院微生物学教研室山东青岛266071 滨州医学院附属医院无棣医院山东滨州251900

目的:探讨血浆DNA和HBV-DNA载量在病毒性肝炎肝硬化后原发性肝癌(PHC)的诊断价值。方法:用RT-PCR方法随访检测HBsAg阳性且经彩色B超诊断为肝硬化的患者,每6个月检测一次患者的血液循环DNA和HBV-DNA载量,直到经临床症状、彩色B超、CT诊... 详细信息

目的:探讨血浆DNA和HBV-DNA载量在病毒性肝炎肝硬化后原发性肝癌(PHC)的诊断价值。方法:用RT-PCR方法随访检测HBsAg阳性且经彩色B超诊断为肝硬化的患者,每6个月检测一次患者的血液循环DNA和HBV-DNA载量,直到经临床症状、彩色B超、CT诊断为原发性肝癌为止。结果:在PHC中,循环DNA 61.3±31.9ng/ml,健康对照组20.3±9.9ng/ml,两组差异显著(P<0.01);而HBV-DNA载量,在PHC确诊时多数处于较低水平,78%≤105copies/ml,与PHC确诊前有明显差异(P<0.01)。PHC未发生淋巴结转移者循环DNA 51.2±17.9ng/ml,淋巴结转移者循环DNA 73.9±23.7ng/ml,两者存在差异(P<0.05);而HBV-DNA载量有无淋巴结转移无明显差异。结论:联合检测血液循环DNA和HBV-DNA载量对PHC的预测、预后价值明显,且方法简单,易于开展。

关键词：原发性肝癌血循环DNA HBV-DNA

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EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建与表达

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中国病毒病杂志 2011年第4期1卷 282-286页

作者：薛庆节王晖李秀真吕厚东陈廷朱伟李士根济宁医学院医学微生物学教研室山东济宁272013

目的构建EB病毒基因LMP2A、BZLF1重组分泌性表达质粒Ag85B,然后将它成功转化成卡介苗。方法分别用PCR扩增Ag85B信号序列和LMP2A和BZLF1融合基因,将Ag85B信号序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒pMV261重组构建获得质粒pMVS。然后将LMP2A和BZ... 详细信息

目的构建EB病毒基因LMP2A、BZLF1重组分泌性表达质粒Ag85B,然后将它成功转化成卡介苗。方法分别用PCR扩增Ag85B信号序列和LMP2A和BZLF1融合基因,将Ag85B信号序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒pMV261重组构建获得质粒pMVS。然后将LMP2A和BZLF1融合基因Z2A与质粒pMVS重组获得质粒pMVZ2A,将其电转化卡介苗,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对其结果进行分析。结果信号序列与LMP2A和BZLF1融合基因被正确插入分泌表达载体pMV261。重组质粒经限制性内切酶双酶切、PCR扩增、基因测序等鉴定。蛋白纯化后可得到一条带。结论 pMVZ2A在BCG中能够分泌表达,本研究为获得抗结核杆菌和EB病毒的双价疫苗奠定了基础。

关键词：人类疱疹病毒4型卡介苗基因融合基因载体 Z2A

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表观遗传学药物影响乳腺癌细胞系抑癌基因BRCA1及CHD5表达的研究

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山东大学学报（医学版） 2011年第7期49卷 29-34页

作者：王新刚王笑峰李福年侯琳杨其峰山东大学齐鲁医院乳腺外科济南250012 青岛大学医学院附属医院乳腺外科山东青岛266100 青岛大学医学院微生物学教研室山东青岛266021 青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室山东青岛266021

目的明确表观遗传学药物对乳腺癌细胞系抑癌基因BRCA1及CHD5表达的作用,探讨此类药物在乳腺癌临床治疗中的合理应用。方法采用去甲基化制剂5-AZA和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA分别作用于乳腺癌细胞系T47D、MCF-7及乳腺正常上皮细胞HBL-10... 详细信息

目的明确表观遗传学药物对乳腺癌细胞系抑癌基因BRCA1及CHD5表达的作用,探讨此类药物在乳腺癌临床治疗中的合理应用。方法采用去甲基化制剂5-AZA和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA分别作用于乳腺癌细胞系T47D、MCF-7及乳腺正常上皮细胞HBL-100,5-AZA终浓度分别为0、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0μmol/L,TSA终浓度分别为0、0.25、0.5、0.75、1.0和1.5μmol/L。荧光定量RT-PCR检测各浓度5-AZA作用12、24、48及72 h,各浓度TSA作用6、12、24、48及72 h BRCA1和CHD5的表达水平,并行甲基化特异PCR(MSP)检测两基因的甲基化状态。结果 2.5μmol/L AZA和0.5μmol/L TSA作用可提高乳腺癌细胞系BRCA1及CHD5的表达,而10μmol/L AZA和1.0、1.5μmol/L TSA作用反致表达降低,且对乳腺正常上皮细胞呈毒性作用。MSP未能发现AZA和TSA对MCF-7细胞两抑癌基因及T47D细胞BRCA1甲基化状态的影响,而两种药物均可逆转T47D细胞CHD5的甲基化状态。结论表观遗传学药物对乳腺癌细胞抑癌基因表达的影响具有给药剂量及时间限制性,本研究可为此类药物在乳腺癌治疗中的科学应用提供实验依据。

关键词：乳腺肿瘤表观遗传学基因,BRCA1 基因,CHD5

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嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统F和E基因序列测定

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青岛大学医学院学报 2011年第1期47卷 1-4页

作者：辛晓妮闫志勇罗玮杨丽胡明侯云青岛大学医学院微生物学教研室山东青岛266071

目的克隆并测定嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统部分编码基因GspF和Gsp E的完整基因序列。方法分别根据已获得的嗜麦芽寡养单胞菌D2株部分序列,以及GenBank收录的K279a和R551株的序列依次设计3组引物,移步法PCR扩增GspF和E基因,产物... 详细信息

目的克隆并测定嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统部分编码基因GspF和Gsp E的完整基因序列。方法分别根据已获得的嗜麦芽寡养单胞菌D2株部分序列,以及GenBank收录的K279a和R551株的序列依次设计3组引物,移步法PCR扩增GspF和E基因,产物纯化后连接pMD18T载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后进行测序分析,将获得各PCR片段进行拼接,最终获得GspF和E基因的完整编码基因,并在GenBank中进行对比分析。结果 PCR先后扩增获得的3段序列,测序并拼接后发现其含有两个完整开放读码框架,分别为长1200 bp的GspF基因(GenBank收录号为GU377212.1)和长1434 bp的GspE基因(GenBank收录号为HM151387)。在GenBank中BLAST分析发现,D2株与嗜麦芽寡养单胞菌R551-3菌株的GspF基因及氨基酸序列同源性分别为93%和98%;GspE基因及氨基酸序列同源性与同菌种菌分别为92%和99%。结论成功克隆出嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统基因簇中的GspF和GspE完整编码序列;嗜麦芽寡养单胞菌GspF和GspE种内高度保守,而其他细菌差异显著,提示其Ⅱ型分泌机制可能与其他革兰阴性菌有一定差异。

关键词：嗜麦芽寡养单胞菌 Ⅱ型分泌系统转膜蛋白序列分析

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铜绿假单胞菌毒力基因检测及临床意义

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临床检验杂志 2011年第4期29卷 301-303页

作者：类承斌晁艳孙相红李慧何宏曲彦青岛大学医学院微生物学教研室山东青岛266021 淄博市中心医院检验科山东淄博255036 青岛大学医学院附属医院山东青岛266003 青岛大学医学院附属市立医院ICU室山东青岛266071

目的检测淄博和青岛地区107例铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)临床分离株毒力基因存在情况。方法用ATB系统鉴定Pa;PCR法检测分离菌株exoU、exoS、pcrV、exoT以及exoY 5种毒力基因。结果 exoU和exoS 2种基因在分离菌株中相互排... 详细信息

目的检测淄博和青岛地区107例铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)临床分离株毒力基因存在情况。方法用ATB系统鉴定Pa;PCR法检测分离菌株exoU、exoS、pcrV、exoT以及exoY 5种毒力基因。结果 exoU和exoS 2种基因在分离菌株中相互排斥;黏液型与非黏液型Pa菌株5种毒力基因的阳性率无显著性差异(P>0.05);淄博地区Pa毒力基因exoU阳性率高于青岛地区(P<0.01),exoS阳性率低于青岛地区(P<0.05)。结论 exoU和exoS 2种基因可能占据相同的染色体位点,两者不能共存;Pa黏液型与非黏液型的毒力基因携带情况相似;Pa毒力基因携带存在一定的地域性差别。

关键词：铜绿假单胞菌毒力基因 Ⅲ型分泌系统聚合酶链反应

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