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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2014年第5期32卷 327-333页

作者：刘鹏张仁刚张洁敬保迁川北医学院免疫学与分子生物学研究所南充637000

目的克隆杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)无鞭毛体特异表达新基因,观察其编码蛋白的亚细胞定位。方法制备杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体m RNA,以消减抑制杂交技术筛选无鞭毛体新的表达序列标签,扩增含有新表达序列标签的基因全... 详细信息

目的克隆杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)无鞭毛体特异表达新基因,观察其编码蛋白的亚细胞定位。方法制备杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体m RNA,以消减抑制杂交技术筛选无鞭毛体新的表达序列标签,扩增含有新表达序列标签的基因全长c DNA,Northen杂交和RT-PCR检测新基因在前鞭毛体和无鞭毛体中的表达,共表达方法观察杜氏利什曼原虫内新基因编码蛋白的亚细胞定位。结果构建了杜氏利什曼原虫无鞭毛体表达序列标签消减文库,克隆到一个新基因,命名为表达位点相关基因样蛋白(ESAGLP)基因,其c DNA全长为2 258 bp,编码620 aa。ESAGLP基因仅在无鞭毛体内表达,其编码蛋白定位于线粒体。结论 ESAGLP鉴定为杜氏利什曼原虫无鞭毛体新基因,其编码蛋白定位于无鞭毛体的线粒体。

关键词：杜氏利什曼原虫 ESAG样蛋白表达定位消减抑制杂交

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杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的比较蛋白质组学分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2009年第2期27卷 102-106页

作者：敬保迁邓世山张仁刚张洁川北医学院免疫学与分子生物学研究所南充637000

目的应用蛋白质组学技术分析杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体蛋白质表达状况。方法分别提取和纯化杜氏利什曼原虫四川SC6株前鞭毛体与纯培养无鞭毛体的总蛋白,分别经pH3～10的预制胶条进行双向电泳分离,凝胶用考马斯亮蓝染色,凝胶图像... 详细信息

目的应用蛋白质组学技术分析杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体蛋白质表达状况。方法分别提取和纯化杜氏利什曼原虫四川SC6株前鞭毛体与纯培养无鞭毛体的总蛋白,分别经pH3～10的预制胶条进行双向电泳分离,凝胶用考马斯亮蓝染色,凝胶图像以PDQuest1.0软件分析,并对主要差异表达蛋白点用电喷雾质谱法进行鉴定。结果等量的前鞭毛体与纯培养的无鞭毛体总蛋白经双向电泳分离后均可获近700个蛋白点,其中超过90%的蛋白点的分布和相对强度基本一致。与前鞭毛体比较,6个蛋白点在无鞭毛体蛋白中明显高表达,3个蛋白点低表达。6个明显高表达的蛋白点中有5个为已知功能蛋白,分别为Reiske铁硫蛋白前体、α微管蛋白、过氧化物酶1、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶前体和甘露糖-1-磷酸瓜氨酸转移酶;3个低表达的蛋白点中有2个为已知功能蛋白,分别为热休克蛋白70和β微管蛋白。这些差异调节表达蛋白与碳水化合物/能量代谢,应激反应,细胞膜和细胞骨架形成相关。结论前鞭毛体与无鞭毛体蛋白质的表达存在差异。

关键词：杜氏利什曼原虫前鞭毛体无鞭毛体比较蛋白质组学

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不同种(株)利什曼原虫毒力相关基因的表达差异

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2009年第4期27卷 307-311页

作者：张仁刚张洁敬保迁川北医学院免疫学与分子生物学研究所南充637000

目的观察不同种(株)利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的毒力相关基因表达情况。方法制备杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、热带利什曼原虫、硕大利什曼原虫和墨西哥利什曼原虫等5种7株利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的总RNA,采用半定量RT-PC... 详细信息

目的观察不同种(株)利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的毒力相关基因表达情况。方法制备杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、热带利什曼原虫、硕大利什曼原虫和墨西哥利什曼原虫等5种7株利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的总RNA,采用半定量RT-PCR法,以α-微管蛋白基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)作为阳性对照,根据GenBank公布的GDP甘露糖焦磷酸酶基因(GDPMP)、A2抗原相关蛋白基因(A2rel)、脂磷酸多糖合成蛋白1基因(LPG1)、脂磷酸多糖合成蛋白2基因(LPG2)、动基体膜蛋白11基因(KMP-11)、胱氨酸蛋白酶C基因(CPC)、亲水性酰化表面蛋白B1基因(HASPB1)、胱氨酸蛋白酶2基因(CPB2)、胱氨酸蛋白酶B2.8基因(CPB2.8)和热激蛋白100基因(CLPb)等毒力相关基因的核苷酸序列,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,分析以上各基因在各种(株)前鞭毛体和无鞭毛体中的表达情况。结果各毒力基因在不同种(株)利什曼原虫的前鞭毛体和无鞭毛体中的表达明显不同,HASPB1基因在7个种(株)利什曼原虫的无鞭毛体和杜氏利什曼原虫前鞭毛体中均表达,GDPMP、LPG1、LPG2、CPB2.8、CPB2、A2rel和CLP基因分别在特定种(株)的前鞭毛体和/或无鞭毛体中表达,CPC基因仅在杜氏利什曼原虫SC10株和硕大利什曼原虫无鞭毛体内表达,KMP-11基因在7个种(株)利什曼原虫前鞭毛体或无鞭毛体内均不表达。结论毒力相关基因的表达存在种特异性和期特异性。

关键词：利什曼原虫毒力相关基因表达

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SLE患者淋巴细胞Fas、Bcl-2、p53与Cmyc基因表达

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免疫学杂志 2009年第1期25卷 115-116页

作者：杨宗琪杨继文任碧轩唐恩洁川北医学院免疫学与分子生物学研究所

@@ 凋亡基因Fas、抗癌基因p53与癌基因Bcl-2、Cmyc等与细胞凋亡密切相关,与疾病的发生、发展有一定的关系,系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病,为了探讨SLE与凋亡基因、癌基因的关系,我们采用简易原位杂交法对正常人与患者淋巴细... 详细信息

@@ 凋亡基因Fas、抗癌基因p53与癌基因Bcl-2、Cmyc等与细胞凋亡密切相关,与疾病的发生、发展有一定的关系,系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病,为了探讨SLE与凋亡基因、癌基因的关系,我们采用简易原位杂交法对正常人与患者淋巴细胞的4种基因成批同时进行检测,并分别设探针对照,dig-AP对照,报道如下.

关键词：原位杂交 Fas Bcl-2 p53 Cmyc SLE 细胞凋亡

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重组杜氏利什曼原虫Pxn1、TryP、假定蛋白CAJ07026和GDPMP蛋白刺激BALB/c小鼠的免疫应答状态

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2017年第6期35卷 563-569页

作者：敬保迁谢勇恩胡为民杨健王朝莉冯莉川北医学院免疫学与分子生物学研究所南充637000

目的观察重组杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)过氧化物还原酶1(peroxidoxin-1,Pxn1)、锥虫氧化还原过氧化物酶(tryparedoxin peroxidase,Try P)、假定蛋白CAJ07026(hypothetical protein CAJ07026.1,Hyp07026)和甘露糖-1-磷酸胍氨酸转移酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GDPMP)蛋白刺激BALB/c小鼠免疫应答状况。方法逆转录PCR(RT-PCR)分别扩增杜氏利什曼原虫Pxn1、Try P、Hyp07026和GDPMP编码基因,克隆入质粒p QE30,构建重组质粒p QE30-Pxn1、p QE30-Try P、p QE30-Hyp07026和p QE30-GDPMP,转化至大肠埃希菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。采用NTA-Ni盐凝胶层析柱,自然条件方式纯化重组蛋白rPxn1和rTry P,变性条件方式纯化重组蛋白rHyp07026和rGDPMP。25只BALB/c小鼠随机均分成5组,即rPxn1、rTry P、rHyp07026、rGDPMP免疫组及PBS对照组,免疫组小鼠分别以相应重组蛋白进行免疫,第1周免疫组小鼠皮下注射100μg相应的重组蛋白,隔周以50μg相应的重组蛋白加强免疫3次,对照组小鼠注射等量PBS。第3次加强免疫后1周,将各组小鼠脱颈处死,制备单个脾细胞,提取抗原刺激后小鼠脾细胞总RNA,用q RT-PCR微阵列检测抗原刺激后小鼠脾细胞内反映免疫应答的细胞因子转录水平表达谱。结果Pxn1、Try P、Hyp07026和GDPMP编码基因经PCR扩增,其产物大小分别为570、610、1 040和1 200 bp;经测序证实,与Gen Bank中的相关序列一致。重组质粒p QE30-Pxn1、p QE30-Try P、p QE30-Hyp07026和p QE30-GDPMP经IPTG诱导后均可在大肠埃希菌内高效表达,rGDPMP、rPXNT1、rTXNT和rHyp07026蛋白相对分子质量(Mr)分别为45 000、22 000、23 000和38 000。rGDPMP、rPXNT1、rTXNT和rHyp07026免疫小鼠的脾细胞内84个细胞因子基因的m RNA表达中,与PBS对照小鼠脾细胞比较,高水平表达的IL-1f6分别是对照组的96.22、271.54、108.51和250.15倍,IL-17f分别是对照组的105.54、35.71、53.38和53.57倍,IL-10分别是对照组的21.68、27.51、24.45和2.91倍。低水平表达的IL-4分别是对照组的5.74、2.43、1.59和0.71倍,IL-12β分别是对照组的0.05、0.26、0.10和0.50倍,IL-18分别是对照组的0.12、0.21、0.13和0.04倍,IFN-γ分别是对照组的3.59、0.39、0.29和0.63倍。结论杜氏利什曼原虫重组蛋白rPxn1、rTry P、rHyp07026和rGDPMP可刺激小鼠炎症反应及诱导免疫抑制。

关键词：杜氏利什曼原虫过氧化物还原酶1 锥虫氧化还原过氧化物酶假定蛋白CAJ07026 甘露糖-1-磷酸胍氨酸转移酶免疫原性

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不同种株利什曼原虫的比较蛋白质组学分析

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中国人兽共患病学报 2009年第5期25卷 410-413页

作者：沈成义邓世山张仁刚张洁敬保迁川北医学院免疫学与分子生物学研究所南充637000

目的观察不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质表达状况。方法制备杜氏利什曼原虫四川SC6株、杜氏利什曼原虫四川SC10株和硕大利什曼原虫5ASKH株前鞭毛体总蛋白,以pH范围3-10的预制胶条进行双向电泳(2-D),考马斯亮蓝染色,PDQust软件分析凝... 详细信息

目的观察不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质表达状况。方法制备杜氏利什曼原虫四川SC6株、杜氏利什曼原虫四川SC10株和硕大利什曼原虫5ASKH株前鞭毛体总蛋白,以pH范围3-10的预制胶条进行双向电泳(2-D),考马斯亮蓝染色,PDQust软件分析凝胶,主要差异蛋白点用电喷雾质谱法进行鉴定。结果等量的杜氏利什曼原虫四川SC6株、杜氏利什曼原虫四川SC10株和硕大利什曼原虫5ASKH株前鞭毛体总蛋白均获近700个蛋白点,不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质2-D图谱中,14蛋白点呈恒定差异表达,从中鉴定出10个功能明确的蛋白质,分别具有下列生物功能:糖代谢与磷脂合成(烯醇酶、变旋酶、NADP依耐乙醇脱氢酶、乙醇胺磷酸胞苷酸转移酶),压力反应(细胞内过氧化物酶、锥虫还原蛋白过氧化物酶),细胞膜/细胞骨架(α-微管蛋白、β-微管蛋白),核酸代谢(琥珀酰辅酶A连接酶(GDP形成)、内源性RNA酶L-PSP(pb5)),细胞周期与增殖(延伸因子2)。结论不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质的表达存在不同,为理解不同种株利什曼原虫的毒力、免疫原性和代谢特征提供了新的视角。

关键词：利什曼原虫比较蛋白质组学表达

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Intimin及其受体Tir在致病性大肠杆菌致细胞线粒体功能障碍中的作用

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中国生物制品学杂志 2010年第12期23卷 1304-1307页

作者：杨健王朝莉冯丽川北医学院免疫学与分子生物学研究所四川南充637000

目的探讨致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)外膜蛋白Intimin及其受体Tir在EPEC致HeLa细胞线粒体功能障碍中的作用。方法将EPEC外膜蛋白Intimin及其受体Tir删除株、相应质粒互补株或染色体互补株感染HeLa细胞,用... 详细信息

目的探讨致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)外膜蛋白Intimin及其受体Tir在EPEC致HeLa细胞线粒体功能障碍中的作用。方法将EPEC外膜蛋白Intimin及其受体Tir删除株、相应质粒互补株或染色体互补株感染HeLa细胞,用线粒体膜电位(Mitochondria membrane potential,MMP)检测试剂JC-1染色细胞线粒体,通过多功能酶标仪检测MMP水平,Western blot检测Intimin的表达及Tir的转位。结果与野生型菌株相比,Eae删除株和Tir删除株感染细胞的MMP功能显著减弱(P<0.05),Eae删除株功能能被质粒表达相应蛋白所互补,Tir删除株不能被质粒表达Tir互补,但可被染色质表达野生型Tir或TirY474S互补,而染色质TirS434A突变株不能引起明显的MMP下降。结论 Intimin和Tir是参与线粒体功能障碍的重要分子;TirS434在线粒体功能障碍中起重要作用。

关键词：致病性大肠杆菌细菌外膜蛋白质类 Intimin 受体线粒体功能障碍删除突变

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不同种株利什曼原虫对Balb/c小鼠和金黄地鼠的致病性研究

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四川动物 2009年第2期28卷 202-206,F0003页

作者：张仁刚张洁敬保迁川北医学院免疫学与分子生物学研究所四川南充637000

为了比较不同种株利什曼原虫对实验动物的致病性,分别将5×107的杜氏利什曼原虫SC6株、热带利什曼原虫K27株、婴儿利什曼原虫LEM235株和婴儿利什曼原虫KXG-Liu株前鞭毛体与无鞭毛体感染Balb/c小鼠和金黄地鼠,观察各感染动物皮肤损... 详细信息

为了比较不同种株利什曼原虫对实验动物的致病性,分别将5×107的杜氏利什曼原虫SC6株、热带利什曼原虫K27株、婴儿利什曼原虫LEM235株和婴儿利什曼原虫KXG-Liu株前鞭毛体与无鞭毛体感染Balb/c小鼠和金黄地鼠,观察各感染动物皮肤损害状况,3月后,有限稀释培养法分别检测肝和脾脏内的虫荷数。发现不同种株利什曼原虫引起的疾病存在极大的异质性,杜氏利什曼原虫四川SC6株致Balb/c小鼠轻微皮肤损害,肝和脾脏内重度虫荷数,金黄地鼠肝和脾脏内重度虫荷数;热带利什曼原虫K27株致Balb/c小鼠严重的皮肤损害,但肝和脾脏的虫荷数较低,金黄地鼠肝和脾脏中未查见原虫;婴儿利什曼原虫LEM235株致Balb/c小鼠严重的皮肤损害,肝和脾脏内重度虫荷数,金黄地鼠肝和脾脏内重度虫荷数;婴儿利什曼原虫KXG-Liu株可致Balb/c小鼠严重的皮肤损害,肝和脾脏中度虫荷数,金黄地鼠肝和脾脏内少量虫荷数。另外,还发现原虫的生活史状态和进入机体的途径及实验动物的类型对不同种株利什曼原虫感染致病产生影响。

关键词：利什曼原虫感染 Balb/c 金地鼠

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FTY720诱导1型1-磷酸鞘氨醇受体内化与其保守基序的关系研究

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中国免疫学杂志 2009年第7期25卷 613-616页

作者：胡为民唐恩洁敬保迁任碧轩川北医学院微生物学与免疫学教研室南充637007 川北医学院免疫学与分子生物学研究所南充637007

目的:研究FTY720诱导1型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P1)内化与后者保守基序之间的关系。方法:以HA-S1P1(WT)-Myc-EGFP-N1融合表达载体为模板,应用重叠PCR的方法,将S1P1保守基序ERY突变为ENY,构建HA-S1P1(R142N)-Myc-EGFP-N1融合表达载体。测序... 详细信息

目的:研究FTY720诱导1型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P1)内化与后者保守基序之间的关系。方法:以HA-S1P1(WT)-Myc-EGFP-N1融合表达载体为模板,应用重叠PCR的方法,将S1P1保守基序ERY突变为ENY,构建HA-S1P1(R142N)-Myc-EGFP-N1融合表达载体。测序鉴定后,经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。100 nmol/LFTY720处理3、6、12小时后,荧光显微镜下观察S1P1在HEK293细胞上的表达情况。结果:HA-S1P1(R142N)-Myc-EGFP-N1载体被成功构建,S1P1(WT)和S1P1(R142N)蛋白表达在HEK293稳定细胞株的表面,FTY720能诱导S1P1(WT)内化,但不能诱导S1P1(R142N)内化。结论:FTY720诱导S1P1内化与ERY保守基序有关。

关键词： FTY720 1型1-磷酸鞘氨醇受体内化荧光显微镜

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RNA干扰体外抑制HBeAg的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2006年第5期22卷 670-671,673页

作者：杨健胡为民任碧轩唐恩洁川北医学院免疫学与分子生物学研究所四川南充637007

目的:构建乙型肝炎病毒前C/C基因小发夹RNA(shRNA)表达载体,探索shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制作用。方法:用基因重组技术构建shRNA表达载体,经酶切、测序鉴定后,与HBeAg表达载体pcDNA3.1preC/C按7∶1的比例,共转染HeLa细胞,采用半定... 详细信息

目的:构建乙型肝炎病毒前C/C基因小发夹RNA(shRNA)表达载体,探索shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制作用。方法:用基因重组技术构建shRNA表达载体,经酶切、测序鉴定后,与HBeAg表达载体pcDNA3.1preC/C按7∶1的比例,共转染HeLa细胞,采用半定量PCR和微粒子酶免疫试验(MEIA)分析shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制情况。结果:经限制性内切酶、测序证实成功构建shRNA表达载体;筛选到psiHBV2载体对HBeAg表达有一定抑制作用,对mRNA的抑制率为75%,对蛋白质的抑制率为53%,其余两序列无明显抑制作用。结论:RNAi技术可以有效抑制载体pcDNA3.1preC/C表达HBeAg。

关键词：乙型肝炎乙型肝炎病毒e抗原小发夹RNA RNA干扰

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