检索结果-内蒙古大学图书馆

广东海洋大学学报 2023年第4期43卷 52-61页

作者：黄鉴涛胡海浩马嘉霖战盈瑾闫秀英简纪常广东海洋大学水产学院/广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室广东湛江524088

【目的】鉴定草鱼(Ctenopharyngodon idella)miR-218(cid-miR-218)家族成员,分析cid-miR-218在鱼淋巴囊肿病毒中国株(LCDV-cn)感染草鱼卵巢细胞系(Grass carp ovary cells,GCO)过程中的表达特性,探索cid-miR-218-5p对LCDV-cn感染的调控作用。【方法】从LCDV-cn感染的GCO细胞中,通过茎环RT-PCR获取cid-miR-218家族成员,并进行测序验证和生物信息学分析;用定量PCR分析cid-miR-218家族在LCDV-cn感染GCO过程中的表达;用生物信息学方法预测cid-miR-218家族的靶基因,并利用双荧光素酶报告基因系统验证cid-miR-218-5p的靶基因;通过转染cid-miR-218-5p mimic和cid-miR-218-5p inhibitor上调和下调cid-miR-218-5p的表达,用定量PCR分析cid-miR-218-5p、靶基因il-10和LCDV-cn mcp基因的表达情况;应用GO和KEGG数据库,对cid-miR-218家族可能参与调控的信号通路进行富集分析。【结果】在LCDV-cn感染GCO过程中,鉴定到cid-miR-218-5p、cid-miR-218a、cid-miR-218b、cid-miR-218b-1和cid-miR-218b-2等5个cid-miR-218家族成员,其中cid-miR-218-5p的表达呈先升后降再上升的变化趋势,且差异表达最显著(P<0.05);经生物信息学分析预测,cid-miR-218家族成员有较多共同的潜在靶基因,il-10是共有的靶基因。经验证,pmirGLO-il-10重组质粒与家族成员代表cid-miR-218-5p结合后,其荧光素酶活性降低(P<0.05),证明il-10是cid-miR-218-5p的靶基因。cid-miR-218-5p过表达后,il-10与LCDV-cn mcp表达均显著下降(P<0.05),而抑制cid-miR-218-5p表达后,il-10与LCDV-cn mcp表达则显著上升(P<0.05)。预测表明cid-miR-218家族参与调控病毒感染致瘤相关信号通路。【结论】在LCDV-cn感染GCO过程中,cid-miR-218家族中cid-miR-218-5p起重要调控作用;cid-miR-218-5p负调控其靶基因il-10的表达,并负调控LCDV-cn mcp基因的表达;cid-miR-218-5p和IL-10对鱼淋巴囊肿病诊断和防控有潜在的临床应用价值。

关键词：草鱼卵巢细胞系 cid-miR-218家族鱼淋巴囊肿病毒中国株靶基因白介素10

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尼罗罗非鱼核糖体蛋白S6基因克隆及组织表达分析

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基因组学与应用生物学 2022年第6期41卷 1193-1201页

作者：巫祎琴张志强陈福暖江栢坚简纪常黄瑜广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室湛江524088 水产经济动物病害控制广东省普通高等学校重点实验室湛江524088

核糖体蛋白S6(ribosomal protein S6,RPS6)是构成40S小亚基核糖体的关键蛋白之一,在蛋白质合成、调控细胞周期和凋亡、调节肿瘤细胞增殖和转移等方面具有重要作用。为探究RPS6在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中的分子结构、表达特... 详细信息

核糖体蛋白S6(ribosomal protein S6,RPS6)是构成40S小亚基核糖体的关键蛋白之一,在蛋白质合成、调控细胞周期和凋亡、调节肿瘤细胞增殖和转移等方面具有重要作用。为探究RPS6在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中的分子结构、表达特性和生物学功能,本研究从尼罗罗非鱼中克隆获得RPS6基因的编码区序列(GenBank登录号:XM_003454192.4;命名为On-RPS6),并采用qPCR法分析该基因在健康鱼体各组织的分布特征以及无乳链球菌刺激后该基因在鱼体肝脏、脾脏、脑和头肾中的表达模式。结果显示:On-RPS6的开放阅读框长度为750 bp,编码249个氨基酸,理论分子量为28.70 kDa,等电点为10.90。氨基酸序列分析显示,On-RPS6具有一个高度保守的核糖体蛋白S6e结构域,且与其他物种具有较高同源性。系统进化树分析表明,尼罗罗非鱼RPS6与斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)RPS6聚为一支,表明二者具有较近的亲缘关系。qPCR结果显示,尼罗罗非鱼各组织均能检测到On-RPS6基因mRNA的表达,且在血液中的表达量最高;经无乳链球菌刺激后,On-RPS6基因在肝脏、脾脏、脑和头肾中的表达模式均呈现先上调后下降的趋势。结果表明,On-RPS6在尼罗罗非鱼抵抗细菌感染的免疫应答过程中发挥了重要作用。

关键词：尼罗罗非鱼核糖体蛋白S6 基因克隆表达分析无乳链球菌

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草鱼miR-1260对鱼淋巴囊肿病毒中国株复制的调控作用

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广东海洋大学学报 2024年第3期44卷 25-33页

作者：马嘉霖战盈瑾周杰黄鉴涛闫秀英简纪常广东海洋大学水产学院/广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室广东湛江524088

【目的】鉴定草鱼(Ctenopharyngodon idella)miR-1260(cid-miR-1260),分析cid-miR-1260在鱼淋巴囊肿病毒中国株(Lymphocystis disease virus China,LCDV-cn)感染草鱼卵巢细胞系(Grass carp ovary cells,GCO)过程中的时序表达特性,揭示cid-miR-1260对其靶基因znf574和LCDV-cn复制的调控作用。【方法】制备LCDV-cn感染的GCO细胞,通过茎环RT-PCR和测序鉴定cid-miR-1260;采用定量PCR检测cid-miR-1260在LCDV-cn感染GCO过程中的时序表达;应用生物信息学方法预测cid-miR-1260的靶基因,并用双荧光素酶报告基因系统验证靶基因;通过转染cid-miR-1260 mimic和cid-miR-1260 inhibitor使cid-miR-1260过表达和抑制表达,并用定量PCR检测cid-miR-1260、靶基因znf574、LCDV-cn mcp基因的表达;应用Reed-Muench法测定LCDV-cn在GCO细胞中的滴度。【结果】cid-miR-1260与其他已知miR-1260仅有一个碱基差异,且cid-miR-1260在LCDV-cn感染GCO过程中呈先上升后下降的表达变化,72 h时表达量最高(P<0.05);生物信息学分析表明,znf574为cid-miR-1260的靶基因;重组质粒pmirGLO-znf574-WT与cid-miR-1260 mimic共转染后,荧光素酶活性显著降低(P<0.05),证实znf574为cid-miR-1260的靶基因;cid-miR-1260过表达后,靶基因znf574的表达显著下降(P<0.05),LCDV-cn mcp的表达和LCDV-cn在GCO细胞中的滴度显著上升(P<0.05);抑制cid-miR-1260表达后,靶基因znf574的表达量显著上升(P<0.05),LCDV-cn mcp的表达量和LCDV-cn在GCO细胞中的滴度显著下降(P<0.05)。【结论】LCDV-cn感染GCO细胞后,cid-miR-1260的表达显著上调;在LCDV-cn感染中,cid-miR-1260对其靶基因znf574的表达起负调控作用,且cid-miR-1260表达与LCDV-cn的复制呈正相关,起促LCDV-cn感染作用,而锌指蛋白ZNF574具有抗LCDV-cn作用。本研究为淋巴囊肿病的防治提供新的依据和思路。

关键词：鱼淋巴囊肿病毒中国株草鱼卵巢细胞系 cid-miR-1260 锌指蛋白基因znf574 病毒复制

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鱼类非特异性细胞毒性细胞(NCC)的研究进展

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中国水产科学 2010年第2期17卷 374-380页

作者：魏世娜简纪常吴灶和鲁义善闫秀英广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省高等学校水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524025

自然杀伤细胞(NK)进化上的前体细胞在鱼类中被称作非特异性细胞毒性细胞(NCC),主要来源于血液和淋巴器官,是防御细菌、病毒、寄生性原生动物等入侵的第一道防线,在非特异性免疫中起重要作用,还具有体外杀伤肿瘤细胞的功能。近年来免疫... 详细信息

自然杀伤细胞(NK)进化上的前体细胞在鱼类中被称作非特异性细胞毒性细胞(NCC),主要来源于血液和淋巴器官,是防御细菌、病毒、寄生性原生动物等入侵的第一道防线,在非特异性免疫中起重要作用,还具有体外杀伤肿瘤细胞的功能。近年来免疫荧光显微镜技术表明NCAMP-1和NCCRP-1两种受体蛋白均表达于NCC膜上,并且这种免疫细胞从鱼类到哺乳动物上的进化是保守的,这些膜蛋白在鱼类炎症反应期可能通过颗粒胞吐途径参与抗菌的先天性免疫。本文就NCC的分离鉴定、形态结构、功能受体作用机制等方面的研究成果作一综述,旨在为深入研究NCC在鱼类先天性防御中的作用提供依据。

关键词：非特异性细胞毒性细胞分离鉴定 NCC受体

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无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗的制备及免疫效果评价

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水产学报 2014年第11期38卷 1926-1936页

作者：王蓓李桂欢鲁义善汤菊芬吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室仲恺农业工程学院

为了研究无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗对罗非鱼链球菌病的免疫保护作用,本研究通过PCR和重叠延伸拼接技术(SOEing)获得融合基因Sip-GAPDH,连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)制备DNA疫苗,通过背鳍肌肉注射方式免疫吉富罗非鱼,免疫后第7... 详细信息

为了研究无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗对罗非鱼链球菌病的免疫保护作用,本研究通过PCR和重叠延伸拼接技术(SOEing)获得融合基因Sip-GAPDH,连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)制备DNA疫苗,通过背鳍肌肉注射方式免疫吉富罗非鱼,免疫后第7、28天取样,采用PCR及RT-PCR方法检测pcDNA-Sip-GAPDH在各个组织(包括肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏)中的表达情况。采用ELISA、Real-time PCR法和体外攻毒法分别分析各实验组不同时间血清抗体效价、免疫基因(IgM、IL-1β和CD8)表达变化规律和相对保护率,研究该嵌合性疫苗对吉富罗非鱼的保护效果。结果显示,实验组在免疫接种第7和第28天时,注射点周围的肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏均能检测到嵌合性质粒,实验组罗非鱼血清抗体效价均高于对照组并于21 d时达到峰值(1∶4 096);qPCR数据表明,实验组鱼体胸腺、头肾和脾脏的IgM、IL-1β和CD8基因的mRNA表达量均出现了上调,并且在胸腺、头肾和脾脏中的表达量分别在免疫后第12和第48 h达到峰值;免疫后42 d进行人工攻毒后计算免疫保护率为93.3%。以上研究结果表明,本研究构建的无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗在罗非鱼链球菌病防治中具有潜在的应用价值。

关键词：无乳链球菌罗非鱼 Sip-GAPDH 嵌合基因核酸疫苗免疫保护率

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cid-miR-146a在LCDV-cn感染中的差异表达及其调控作用

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广东海洋大学学报 2022年第4期42卷 31-41页

作者：胡海浩黄鉴涛马嘉霖杨硕闫秀英简纪常广东海洋大学水产学院/广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室广东湛江524088

【目的】在鱼淋巴囊肿中国病毒株(LCDV-cn)感染草鱼卵巢细胞系(GCO)过程中,分析cid-miR-146a的表达特性,探索cid-miR-146a的调控作用。【方法】采用颈环RT-PCR方法,从LCDV-cn感染的GCO细胞中获得cidmiR-146a;在LCDV-cn感染GCO过程中,用... 详细信息

【目的】在鱼淋巴囊肿中国病毒株(LCDV-cn)感染草鱼卵巢细胞系(GCO)过程中,分析cid-miR-146a的表达特性,探索cid-miR-146a的调控作用。【方法】采用颈环RT-PCR方法,从LCDV-cn感染的GCO细胞中获得cidmiR-146a;在LCDV-cn感染GCO过程中,用定量PCR方法获取cid-miR-146a的表达变化;用生物信息学方法预测和双荧光素酶系统验证cid-miR-146a的靶基因;转染cid-miR-146a mimic和cid-miR-146a inhibitor对cid-miR-146a进行上调和下调,用定量PCR检测cid-miR-146a、靶基因Flt1和LCDV-cn mcp基因在GCO中的表达。【结果】LCDV-cn感染GCO后3~6 d细胞聚集形成“疤痕”,之后细胞逐渐脱落、裂解,呈现空洞。cid-miR-146a的长度为23 bp,在LCDV-cn感染GCO过程中,cid-miR-146a的表达先上升(72 h前)后下降(72 h后)。用不同生物信息学方法共同预测到cid-miR-146a的靶基因为Flt1,在双荧光素酶系统验证实验中,cid-miR-146a靶向Flt1重组载体后荧光素酶活性降低(P<0.05),证实Flt1为cid-miR-146a的靶基因。对cid-miR-146a进行上调下调后,GCO中cid-miR-146a的表达差异显著(P<0.05)。在cid-miR-146a上调后,靶基因Flt1的表达显著下降(P<0.05),LCDV-cn mcp基因的表达显著上升(P<0.05);在cid-miR-146a下调后,靶基因Flt1的表达显著上升(P<0.05),LCDV-cn mcp基因的表达显著下降(P<0.05)。【结论】在LCDV-cn感染GCO过程中,CPE的变化与cid-miR-146a的表达变化时间点呈正相关。cid-miR-146a负调控其靶基因Flt1的表达,并对LCDV-cn的复制起着正调控作用。生物信息学方法预测说明cid-miR-146a参与调控的信号通路与免疫和肿瘤发生相关。

关键词：鱼淋巴囊肿病毒中国株草鱼卵巢细胞系草鱼miR-146a Fms相关酪氨酸激酶1 定量PCR

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温度对溶藻弧菌HY9901株致病性相关蛋白的调控

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水生生物学报 2008年第6期32卷 787-793页

作者：庞欢瑛吴灶和简纪常鲁义善广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524025

将溶藻弧菌HY9901株置于15℃、20℃、28℃、37℃四个温度下培养,18h时分别测定细菌含量,胞外蛋白酶(Extracelluar protease,ECPase)表达量以及胞外产物(Extracellular product,ECP)对动物的致死性。结果表明,随着温度升高,菌液浓度、ECP... 详细信息

将溶藻弧菌HY9901株置于15℃、20℃、28℃、37℃四个温度下培养,18h时分别测定细菌含量,胞外蛋白酶(Extracelluar protease,ECPase)表达量以及胞外产物(Extracellular product,ECP)对动物的致死性。结果表明,随着温度升高,菌液浓度、ECPase的活性以及ECP对小鼠和红笛鲷的致死率先升高后下降。28℃培养的细菌浓度、ECPase的活性以及ECP对小鼠和红笛鲷的致死率均为最大。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析不同温度培养下细菌的ECP和外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP),结果显示,不同温度培养的溶藻弧菌ECP和OMP电泳图谱不同。溶藻弧菌主要ECP的分子量为70kD和62kD。ECP 70kD在20℃时的表达量最大,而28℃时ECP62 kD的蛋白浓度最高。45kD OMP随着温度升高,其合成量增大,28℃时达最大值;而40kD和34kD OMP则随着温度的升高而减弱。通过研究电泳纯化的ECP 62kD和ECP 70kD的酶活性和致死试验,证明ECP 62kD具有很强的酶活性和毒性,而ECP 70kD仅具有弱的酶活性和毒性。

关键词：溶藻弧菌胞外产物外膜蛋白胞外蛋白酶温度

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尼罗罗非鱼CD63基因克隆及表达特征分析

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南方农业学报 2024年第12期55卷 3779-3788页

作者：李梓昕陈杨慧卢春兰黄瑜蔡佳王蓓广东海洋大学水产学院/广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室/水产经济动物病害控制广东省普通高校重点实验室广东湛江524088

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)抗原分化簇63基因(CD63)并分析其在病原菌刺激后的表达情况,探究尼罗罗非鱼CD63基因在免疫应答中发挥的作用,为进一步研究CD63的免疫功能提供理论依据。【方法】对尼罗罗非鱼CD63基因进... 详细信息

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)抗原分化簇63基因(CD63)并分析其在病原菌刺激后的表达情况,探究尼罗罗非鱼CD63基因在免疫应答中发挥的作用,为进一步研究CD63的免疫功能提供理论依据。【方法】对尼罗罗非鱼CD63基因进行克隆,利用生物信息学软件对尼罗罗非鱼CD63蛋白进行理化性质分析、跨膜结构域预测和系统进化分析等,采用实时荧光定量PCR检测尼罗罗非鱼CD63基因的组织表达特征及在无乳链球菌感染后的表达变化。【结果】尼罗罗非鱼CD63基因开放阅读框(ORF)长度为723 bp,编码240个氨基酸残基。尼罗罗非鱼CD63蛋白分子量为25.88 kD,理论等电点(pI)为8.38,蛋白平均亲水性系数(GRAVY)为0.745,为疏水性蛋白,不含信号肽,含4个跨膜结构域。进行比对分析发现,尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼等其他鱼类的CD63氨基酸序列相似性较高;系统进化分析结果表明,尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼亲缘关系最近。CD63基因在尼罗罗非鱼的脑、脾脏、肝脏、皮肤、头肾、鳃、心脏、后肠、血液和肌肉10种组织中均有表达,在肌肉中相对表达量最高,其次为血液和后肠,在脑中相对表达量最低。在无乳链球菌感染3~96 h,CD63基因在尼罗罗非鱼的鳃、心脏、头肾、脾脏、后肠、肌肉和皮肤中相对表达量最高值均较未感染时(0 h)显著上调(P<0.05,下同);在感染96 h时,CD63基因在尼罗罗非鱼的脑、鳃、头肾、肝脏、脾脏、后肠、肌肉和皮肤中的相对表达量较最高值均显著下调。【结论】在无乳链球菌感染后,尼罗罗非鱼CD63基因在各组织中的表达均发生明显变化,表明CD63基因参与尼罗罗非鱼对病原菌刺激的免疫应答过程。

关键词：尼罗罗非鱼 CD63基因组织表达无乳链球菌

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尼罗罗非鱼CD2-like基因克隆及其胞外区表达研究

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水产科学 2021年第5期40卷 700-709页

作者：陈福暖高晓琳曾晓怜谢彩霞汪志文鲁义善吴灶和王忠良王蓓广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 广东海洋大学深圳研究院广东深圳518000

依据数据库中预测的尼罗罗非鱼白细胞分化抗原2(CD2)基因(GenBank登录号:XM_005460661.4)序列,采用PCR扩增体质量(150±50)g尼罗罗非鱼CD2分子同源类似物(CD2-like)基因编码区片段,然后以其胞外区构建原核表达质粒pGEX-6P1-CD2L,并... 详细信息

依据数据库中预测的尼罗罗非鱼白细胞分化抗原2(CD2)基因(GenBank登录号:XM_005460661.4)序列,采用PCR扩增体质量(150±50)g尼罗罗非鱼CD2分子同源类似物(CD2-like)基因编码区片段,然后以其胞外区构建原核表达质粒pGEX-6P1-CD2L,并进行原核表达及条件优化,最后进行复性纯化,为进一步研究该CD2-like分子在罗非鱼中的免疫功能奠定基础。研究结果表明,罗非鱼CD2-like(OnCD2-like)基因(GenBank登录号:MN296489)编码区全长1110bp,其中胞外区长558 bp。构建OnCD2-like胞外区的原核表达质粒pGEX-6P1-CD2L,将该重组质粒导入大肠杆菌BL21后,成功表达OnCD2-like胞外段重组蛋白。原核表达结果显示,目的蛋白分子质量为20ku,主要以包涵体形式存在,而该包涵体蛋白复性纯化最佳条件为:37℃下,0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6h,经梯度稀释复性并纯化后可成功获得目的重组蛋白。

关键词：尼罗罗非鱼 CD2-like基因基因克隆原核表达

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尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)NCCRP-1在多种组织中表达的免疫组化研究

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基因组学与应用生物学 2018年第6期37卷 2356-2360页

作者：郑琦黄瑜袁满蔡佳汤菊芬鲁义善吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

非特异性细胞毒性细胞（non-specific cytotoxic cell,NCC）是硬骨鱼中一类淋巴细胞,在非特异性免疫中通过上调炎症反应释放细胞因子发挥重要的作用,是哺乳动物中NK细胞的等价物。鱼类NCC在体内多个组织器官中均有分布,其细胞毒性是自发... 详细信息

非特异性细胞毒性细胞（non-specific cytotoxic cell,NCC）是硬骨鱼中一类淋巴细胞,在非特异性免疫中通过上调炎症反应释放细胞因子发挥重要的作用,是哺乳动物中NK细胞的等价物。鱼类NCC在体内多个组织器官中均有分布,其细胞毒性是自发的,可杀死多种靶细胞,例如同种异源或异种异源肿瘤细胞,寄生性原生动物和被病原侵染的细胞。NCCRP-1是NCC上的一种标志性受体。本研究对尼罗罗非鱼的脑,头肾,肝脏和脾脏进行切片,对NCCRP-1进行染色,通过免疫组化分析得知NCC在这些组织中的分布情况。另外采用Percoll非连续密度梯度法分离纯化得到头肾NCC,采用免疫组化染色和FITC标签标记,与组织中的染色结果分布相同。相较于qPCR等技术,本研究更直观地观察NCC在组织中的分布特点,为深入研究NCC的功能奠定了基础。

关键词：尼罗罗非鱼 NCCRP-1 免疫组化

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