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大连海洋大学学报 2022年第3期37卷 435-440页

作者：王旭东范晨龙丁燏广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室水产经济动物病害控制广东省普通高校重点实验室广东湛江524088

为研究溶藻弧菌Vibrio alginolyticus磷酸甲基嘧啶合酶(phosphomethylpyrimidine synthase,ThiC)是否存在乙酰化修饰,以溶藻弧菌HY9901基因组为模板,PCR扩增ThiC基因,构建pET-28a-ThiC原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,并优化其表达条件,然后用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达及乙酰化情况。结果表明:克隆获得的溶藻弧菌ThiC基因长度为1941 bp;重组蛋白成功在大肠杆菌BL21中表达,相对分子质量为72500,其最佳诱导条件为IPTG 0.1 mmol/L、温度37℃、诱导时间3 h;经Western blot检测显示,ThiC蛋白具有乙酰化修饰,但在体外不能通过乙酰化酶途径去乙酰化。研究表明,溶藻弧菌ThiC原核表达载体构建成功,该蛋白存在乙酰化修饰,但体外不能去乙酰化,本研究结果为溶藻弧菌的维生素合成过程中酶的翻译后调控机制研究提供了科学参考。

关键词：溶藻弧菌磷酸甲基嘧啶合酶原核表达乙酰化

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溶藻弧菌gr基因缺失株构建及其生物学特性

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广东海洋大学学报 2021年第4期41卷 1-7页

作者：冯建儒范晨龙丁燏广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室水产经济动物病害防控广东普通高校重点实验室广东湛江524088

【目的】研究敲除谷胱甘肽还原酶(GR)基因gr对溶藻弧菌HY9901生物学特性的影响。【方法】通过同源重组技术和Overlap PCR等分子生物学手段构建溶藻弧菌HY9901的gr基因缺失株,通过反转录验证并检测其遗传稳定性,绘制该菌的野生株和缺失... 详细信息

【目的】研究敲除谷胱甘肽还原酶(GR)基因gr对溶藻弧菌HY9901生物学特性的影响。【方法】通过同源重组技术和Overlap PCR等分子生物学手段构建溶藻弧菌HY9901的gr基因缺失株,通过反转录验证并检测其遗传稳定性,绘制该菌的野生株和缺失株的生长曲线,测定该菌野生株和缺失株的生物膜形成能力、抗生素敏感性、胞外蛋白酶活性和泳动能力等生物学特性。【结果】gr基因的缺失几乎不影响溶藻弧菌的生长趋势,但敲除gr基因后溶藻弧菌对呋喃唑酮、头孢唑林、四环素等敏感性增强,该菌的生物膜形成能力增强显著提高。缺失株△gr的胞外蛋白酶活性和泳动能力均低于野生株。【结论】谷胱甘肽还原酶在溶藻弧菌的毒力、生物膜形成、药物敏感性、泳动等方面有重要作用。

关键词：溶藻弧菌谷胱甘肽还原酶缺失株生物学特性同源重组

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草鱼NCCRP-1和IL-10的表达、抗体制备及组织病理变化

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广东海洋大学学报 2021年第5期41卷 10-18页

作者：陈静妮代礼平雷燕胡海浩黄鉴涛简纪常闫秀英广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室广东湛江524088 广州利洋水产科技股份有限公司广东广州510515

【目的】制备草鱼(Ctenopharyngodon idella)非特异性细胞毒性细胞受体蛋白-1(NCCRP-1)和白细胞介素-10(IL-10)的抗血清,探讨重组NCCRP-1和IL-10免疫在草鱼抗病毒感染过程中肾脏和肠病理学变化及对NCCRP-1和IL-10表达的影响。【方法】应... 详细信息

【目的】制备草鱼(Ctenopharyngodon idella)非特异性细胞毒性细胞受体蛋白-1(NCCRP-1)和白细胞介素-10(IL-10)的抗血清,探讨重组NCCRP-1和IL-10免疫在草鱼抗病毒感染过程中肾脏和肠病理学变化及对NCCRP-1和IL-10表达的影响。【方法】应用PCR扩增技术获得草鱼NCCRP-1和IL-10开放阅读框ORF,构建原核表达载体pET-NCCRP和pET-IL10;用表达的重组蛋白分别制备兔抗NCCRP-1和IL-10的抗血清,并采用ELISA方法测定抗血清的效价;分别用重组NCCRP-1和IL-10免疫草鱼,并用草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)GD108攻毒,感染7 d后制备草鱼肾脏和肠的病理切片,用定量PCR和western blot检测NCCRP-1和IL-10的表达。【结果】草鱼NCCRP-1和IL-10的ORF分别编码237个和179个氨基酸;草鱼NCCRP-1和IL-10的原核表达载体pET-NCCRP和pET-IL10在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中成功诱导表达,最优表达条件分别是0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导4 h和1.0 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,western blot分析表明重组表达的蛋白为目的蛋白;制备兔抗NCCRP-1和IL-10抗血清的效价均高达1∶40000,免疫和攻毒后,NCCRP-1免疫组草鱼肾脏与肠的病理变化较轻,且NCCRP-1在肾脏与肠中的表达量显著上调(P<0.05);IL-10免疫组草鱼肾脏与肠的病理变化较重,IL-10在肾脏与肠中的表达量变化不显著。【结论】外源性NCCRP-1免疫后增强了草鱼抵御GCRV-GD108感染的免疫应答,NCCRP-1对草鱼抗GCRV GD108感染效果显著;而外源性IL-10免疫后,其对草鱼抗GCRV GD108感染效果不显著。

关键词：草鱼非特异性细胞毒性细胞受体-1 白细胞介素-10 表达多克隆抗体组织病理学

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草鱼呼肠孤病毒GCRV 096 VP7蛋白的表达及免疫原性

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广东海洋大学学报 2020年第4期40卷 1-6页

作者：杨硕陈静妮胡海浩王雅闫秀英简纪常广东海洋大学水产学院//广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室//水产经济动物病害防控广东普通高校重点实验室广东湛江524088

【目的】研究草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)096 vp7基因的原核和真核表达及其编码蛋白的免疫原性。【方法】应用RT-PCR技术获得GCRV 096 vp7基因,构建GCRV 096 vp7基因原核表达载体pET-VP7,用原核表达的GCRV 096 VP7蛋白... 详细信息

【目的】研究草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)096 vp7基因的原核和真核表达及其编码蛋白的免疫原性。【方法】应用RT-PCR技术获得GCRV 096 vp7基因,构建GCRV 096 vp7基因原核表达载体pET-VP7,用原核表达的GCRV 096 VP7蛋白免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)15 d后,用GCRV 096和GCRV GD108分离株对其攻毒,检测GCRV 096 VP7的免疫原性。构建GCRV 096 vp7基因真核表达载体p EGFP-N3-VP7,分析其在草鱼CIK细胞中的表达。【结果与结论】GCRV 096 vp7基因的开放阅读框ORF (GenBank登录号为JN206665)为831 bp,编码276个氨基酸。成功构建GCRV 096 vp7基因原核表达载体pET-VP7,并在大肠杆菌BL21中诱导表达成功;最优表达条件是0.2 mm/L IPTG、28℃下表达5 h,通过HisTrap HP柱纯化融合蛋白,Western blot分析结果表明,所表达的蛋白为目的蛋白。经免疫及GCRV攻毒后,GCRV 096(Ⅰ型)免疫组vp7基因的表达水平降低(P <0.05),而GCRV GD108(Ⅱ型)免疫组vp7基因的表达无显著差异,表明GCRV 096 VP7蛋白对GCRV096具有良好的免疫效果,但对GCRVGD108无明显的免疫效果。成功构建GCRV096vp7基因真核表达载体pEGFP-N3-VP7,Western blot分析结果表明,GCRV 096 VP7蛋白在草鱼肾(CIK)细胞中成功表达。

关键词：草鱼呼肠孤病毒 vp7基因表达免疫原性

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非诺贝特对卵形鲳鲹PPARα及CPTI基因表达的影响

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广东海洋大学学报 2016年第1期36卷 13-18页

作者：方玲玲陈刚王忠良汤保贵张健东黄建盛周晖广东海洋大学水产学院广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088

对卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)腹腔注射20、50、100 mg/kg的激动剂非诺贝特,用RT-PCR检测肝脏、肌肉中PPARα和CPTI基因表达的变化趋势,研究激动剂对卵形鲳鲹PPARα和CPTI基因表达的影响。结果表明,PPARα基因表达量50 mg/kg非诺贝特... 详细信息

对卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)腹腔注射20、50、100 mg/kg的激动剂非诺贝特,用RT-PCR检测肝脏、肌肉中PPARα和CPTI基因表达的变化趋势,研究激动剂对卵形鲳鲹PPARα和CPTI基因表达的影响。结果表明,PPARα基因表达量50 mg/kg非诺贝特组高于其他组,差异有统计学意义(P<0.05),而CPTI表达量在20 mg/kg组有较高的表达水平(P<0.05);50 mg/kg非诺贝特组中PPARα基因表达量随着时间的变化呈现先降低后恢复至初始水平的趋势,CPTI表达量随时间变化先升高后降低,随后又升高的变化趋势,肝脏组织中,CPTI表达量在注射后30 h达到最高(P<0.05),而在肌肉组织中18 h时达到最高值(P<0.05);非诺贝特组PPARα和CPTI基因的表达量均高于PBS对照组(P<0.05)。非诺贝特可诱导PPARα基因的表达,但CPTI与PPARα基因表达无较明显的相关性。

关键词：卵形鲳鲹基因表达 PPARα CPTI 非诺贝特 RT-PCR分析

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草鱼出血病分子流行病学及GCRV多样性研究

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安徽农业科学 2016年第11期44卷 120-125,153页

作者：黄毅昌雷燕杨玉滔闫秀英简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室广东湛江524088 广州利洋水产科技股份有限公司广东广州510515

[目的]分析不同基因型GCRV分离株与患草鱼出血病草鱼症状的相关性。[方法]采用RT-PCR检测患病草鱼,应用生物信息学方法分析基因型内和基因型间不同分离株间的差异。[结果]对近3年来草鱼出血病分子流行病学分析发现,患草鱼出血病病鱼多为... 详细信息

[目的]分析不同基因型GCRV分离株与患草鱼出血病草鱼症状的相关性。[方法]采用RT-PCR检测患病草鱼,应用生物信息学方法分析基因型内和基因型间不同分离株间的差异。[结果]对近3年来草鱼出血病分子流行病学分析发现,患草鱼出血病病鱼多为"肠炎型"症状,且检测发现其病原多属于GCRV基因型Ⅲ型。对GCRV的多样性分析表明,不同分离株同源蛋白的同源率高达93%以上,却被给予完全不同的名称,给GCRV多样性研究带来一定的困难;同一基因型不同分离株同源蛋白间的变异位点较少,且功能位点发生变异的更少;不同基因型不同分离株同源蛋白间的保守位点较少,且这些保守位点中只有极少数位点为功能位点;不同基因型分离株同源结构蛋白间存在较大的差异,且同源非结构蛋白间的差异更为显著。[结论]草鱼出血病不同临床症状可能与其病原基因型不同有关。

关键词：草鱼呼肠孤病毒草鱼出血病分子流行病学多样性

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卵形鲳鲹耐低温候选基因△6FAD全长cDNA序列的克隆与表达分析

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生物技术通报 2015年第7期31卷 115-123页

作者：韩洪波王忠良陈刚汤保贵张健东黄建盛周晖施纲潘传豪广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088

采用c DNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆了卵形鲳鲹△6脂肪酸去饱和酶(△6FAD)的c DNA全长序列,并对其基因和蛋白序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析... 详细信息

采用c DNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆了卵形鲳鲹△6脂肪酸去饱和酶(△6FAD)的c DNA全长序列,并对其基因和蛋白序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析了该基因在不同温度条件下的表达差异及低温下的时序表达模式。结果显示,卵形鲳鲹△6FAD基因c DNA序列全长1 908 bp,其中开放阅读框为1 329 bp,3'非编码区431 bp,5'非编码区135 bp,共编码442个氨基酸;其编码蛋白属于疏水性蛋白,无信号肽特征,含有大量蛋白质二级结构和该家族典型的组氨酸富集区及细胞色素b5结构域。系统进化分析表明,卵形鲳鲹△6FAD基因与尖吻鲈、军曹鱼的△6FAD基因在进化关系上最为接近,其次是大菱鲆、蓝鳍金枪鱼和点带石斑鱼,但与斑马鱼、小鼠和人△6FAD基因进化关系较远。实时荧光定量PCR结果表明,该基因的表达与环境温度和胁迫时间存在明显相关性,其表达水平在降温过程中随温度降低而先缓慢下降后又迅速升高,在不同的低温环境下表现出不同的时序表达模式:13℃时,随时间延长该基因的表达量呈现先降低后又升高至原来水平的变化趋势,16℃和19℃时则表现出一种随时间延长逐渐降低的反馈式调节方式。

关键词：卵形鲳鲹 △6脂肪酸去饱和酶 cDNA克隆低温胁迫

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卵形鲳鲹PPARα基因cDNA序列的克隆、组织表达及生物信息学分析

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广东海洋大学学报 2015年第4期35卷 1-9页

作者：方玲玲陈刚王忠良汤保贵张健东黄建盛周晖广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088

采用RACE-PCR 克隆卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptors-α,PPAR α）基因的cDNA 序列全长,并应用生物信息学方法分析其编码蛋白质的理化性质和结构特征.结果表明... 详细信息

采用RACE-PCR 克隆卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptors-α,PPAR α）基因的cDNA 序列全长,并应用生物信息学方法分析其编码蛋白质的理化性质和结构特征.结果表明：卵形鲳鲹PPAR α 基因（GenBank 登录号KP893147） cDNA 全长1 930 bp,开放阅读框（ORF）为1 425 bp,共编码474 个氨基酸,其编码的蛋白质为不稳定蛋白,无信号肽和跨膜结构,二级结构由α 螺旋、β转角、伸展片段和无规则卷曲组成,且α 螺旋占较大比例;预测显示,该蛋白有PPARs 基因家族典型的DNA 结合区（DBD）和配体结合区（LBD）;序列对比表明,卵形鲳鲹PPAR α 基因与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、花鲈（Lateolabrax japonicas）、大黄鱼（Larimichthys crocea）、金头鲷（Sparus aurata）、军曹鱼（Rachycentroncanadum）等有较高的同源性（81% - 89%）;蛋白系统进化树分析显示,在人（Homo sapiens）、鼠（Mus musculus）、鸭（Gallus gallus）、花鲈、大黄鱼、军曹鱼等动物中,卵形鲳鲹的PPAR α 蛋白与军曹鱼的进化关系最为密切（94%）,与人（68%）、鼠（68%）、鸭（67%）等的同源性较低.荧光定量分析显示,卵形鲳鲹PPAR α mRNA 在脑、肾脏、肠、脾脏等组织表达水平较高,其次是皮肤、肌肉,在心脏、肝脏中表达量较低.

关键词：卵形鲳鲹过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα) 基因克隆 cDNA末端快速扩增(RACE) 生物信息学组织表达

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石斑鱼遗传多样性及其系统发育分析

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安徽农业科学 2015年第29期43卷 75-79页

作者：李庆黄毅昌闫秀英简纪常吴灶和广东海洋大学广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室广东湛江524088

石斑鱼不仅是重要的海水经济鱼类,而且具有重要的生态地位。但是,石斑鱼的分类、物种多样性、资源保护及其合理开发等需要对石斑鱼系统发育的分析与研究。线粒体基因是研究石斑鱼系统进化的理想分子标记,因此获得了青石斑鱼***长度为1 0... 详细信息

石斑鱼不仅是重要的海水经济鱼类,而且具有重要的生态地位。但是,石斑鱼的分类、物种多样性、资源保护及其合理开发等需要对石斑鱼系统发育的分析与研究。线粒体基因是研究石斑鱼系统进化的理想分子标记,因此获得了青石斑鱼***长度为1 039bp的16S r DNA、tRNA-Leu和NA1部分序列,基于其及ND2、cyt b对石斑鱼系统发育进行了分析,结果表明石斑鱼遗传多样性与地域分布关系不大,不同系统树分析都表明同一石斑鱼物种的系统发生关系基本一致,石斑鱼种间亲缘关系较近。此外,也发现某些异种间亲缘关系比同种间亲缘关系近的现象。

关键词：石斑鱼遗传多样性系统发育

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照度对龙虎斑幼鱼行为活动的影响

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广东海洋大学学报 2015年第1期35卷 43-50页

作者：李国聪陈刚黄建盛张健东周晖施纲潘传豪汤保贵王忠良广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088

龙虎斑幼鱼在运输、转池、过筛等过程中存在应激严重、怕人畏光、食欲低下、抗逆力差、成活率低等问题。以体长5.64±0.16cm、体质量4.99±0.46 g的龙虎斑幼鱼为实验对象,于室内自制循环水养殖系统中研究幼鱼在0、50、100、200... 详细信息

龙虎斑幼鱼在运输、转池、过筛等过程中存在应激严重、怕人畏光、食欲低下、抗逆力差、成活率低等问题。以体长5.64±0.16cm、体质量4.99±0.46 g的龙虎斑幼鱼为实验对象,于室内自制循环水养殖系统中研究幼鱼在0、50、100、200、400、800、1 600、3 200 lx等8种照度下的日常行为及摄食状况,实验周期30 d。结果表明：0、50 lx照度组的幼鱼可快速（1 d）适应环境,状态自由,摄食积极;1 600、3 200 lx照度组适应性较差,长时间处于紧张应激状态,于低水层高密度集群;其余各照度组在10 d后达到完全适应状态。摄食水层随着照度的降低而升高,表现出较强的规律性：0 lx〉50 lx〉100 lx〉200 lx〉400 lx〉800 lx〉1 600 lx〉3 200 lx,且15 d前0、50 lx组的摄食水层高于1 600、3 200 lx照度组,差异有统计学意义（P〈0.05）;摄食水平0~800 lx照度组普遍优于1 600、3 200 lx照度组,且10 d前两者差异有统计学意义（P〈0.05）。

关键词：龙虎斑行为活动摄食水层照度

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