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安徽农业科学 2016年第11期44卷 120-125,153页

作者：黄毅昌雷燕杨玉滔闫秀英简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室广东湛江524088 广州利洋水产科技股份有限公司广东广州510515

[目的]分析不同基因型GCRV分离株与患草鱼出血病草鱼症状的相关性。[方法]采用RT-PCR检测患病草鱼,应用生物信息学方法分析基因型内和基因型间不同分离株间的差异。[结果]对近3年来草鱼出血病分子流行病学分析发现,患草鱼出血病病鱼多为... 详细信息

[目的]分析不同基因型GCRV分离株与患草鱼出血病草鱼症状的相关性。[方法]采用RT-PCR检测患病草鱼,应用生物信息学方法分析基因型内和基因型间不同分离株间的差异。[结果]对近3年来草鱼出血病分子流行病学分析发现,患草鱼出血病病鱼多为"肠炎型"症状,且检测发现其病原多属于GCRV基因型Ⅲ型。对GCRV的多样性分析表明,不同分离株同源蛋白的同源率高达93%以上,却被给予完全不同的名称,给GCRV多样性研究带来一定的困难;同一基因型不同分离株同源蛋白间的变异位点较少,且功能位点发生变异的更少;不同基因型不同分离株同源蛋白间的保守位点较少,且这些保守位点中只有极少数位点为功能位点;不同基因型分离株同源结构蛋白间存在较大的差异,且同源非结构蛋白间的差异更为显著。[结论]草鱼出血病不同临床症状可能与其病原基因型不同有关。

关键词：草鱼呼肠孤病毒草鱼出血病分子流行病学多样性

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无乳链球菌sodA基因的克隆、序列分析及原核表达载体构建

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广东海洋大学学报 2016年第3期36卷 15-19页

作者：王松艳蔡双虎鲁义善简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨水产经济动物病害控制广东省普通高等学校重点实验室广东湛江524088

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是引起我国南方罗非鱼链球菌病的主要病原之一,SodA是无乳链球菌重要的毒力因子之一。根据链球菌sod A基因保守区设计引物,采用PCR扩增sod A基因部分序列,反向PCR和巢式PCR扩增其侧翼序列,成功获... 详细信息

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是引起我国南方罗非鱼链球菌病的主要病原之一,SodA是无乳链球菌重要的毒力因子之一。根据链球菌sod A基因保守区设计引物,采用PCR扩增sod A基因部分序列,反向PCR和巢式PCR扩增其侧翼序列,成功获得无乳链球菌sod A基因。无乳链球菌sod A基因序列全长为699 bp,含开放阅读框609 bp,可编码202个氨基酸,演绎的SodA蛋白主要由α螺旋和不规则卷曲构成。BLAST分析表明,该蛋白氨基酸序列与犬链球菌(***)及副乳房链球菌(***)相应蛋白的氨基酸序列相似性分别高达80%和79%。将sodA基因克隆至原核表达载体pET28a上成功构建了重组质粒p ET28a-sod A,导入Escherichia coli BL21(DE3),诱导表达的重组蛋白质分子质量约为24 ku,主要以包涵体形式存在于表达菌中。

关键词：无乳链球菌 sodA基因克隆原核表达

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卵形鲳鲹耐低温候选基因△6FAD全长cDNA序列的克隆与表达分析

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生物技术通报 2015年第7期31卷 115-123页

作者：韩洪波王忠良陈刚汤保贵张健东黄建盛周晖施纲潘传豪广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088

采用c DNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆了卵形鲳鲹△6脂肪酸去饱和酶(△6FAD)的c DNA全长序列,并对其基因和蛋白序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析... 详细信息

采用c DNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆了卵形鲳鲹△6脂肪酸去饱和酶(△6FAD)的c DNA全长序列,并对其基因和蛋白序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析了该基因在不同温度条件下的表达差异及低温下的时序表达模式。结果显示,卵形鲳鲹△6FAD基因c DNA序列全长1 908 bp,其中开放阅读框为1 329 bp,3'非编码区431 bp,5'非编码区135 bp,共编码442个氨基酸;其编码蛋白属于疏水性蛋白,无信号肽特征,含有大量蛋白质二级结构和该家族典型的组氨酸富集区及细胞色素b5结构域。系统进化分析表明,卵形鲳鲹△6FAD基因与尖吻鲈、军曹鱼的△6FAD基因在进化关系上最为接近,其次是大菱鲆、蓝鳍金枪鱼和点带石斑鱼,但与斑马鱼、小鼠和人△6FAD基因进化关系较远。实时荧光定量PCR结果表明,该基因的表达与环境温度和胁迫时间存在明显相关性,其表达水平在降温过程中随温度降低而先缓慢下降后又迅速升高,在不同的低温环境下表现出不同的时序表达模式:13℃时,随时间延长该基因的表达量呈现先降低后又升高至原来水平的变化趋势,16℃和19℃时则表现出一种随时间延长逐渐降低的反馈式调节方式。

关键词：卵形鲳鲹 △6脂肪酸去饱和酶 cDNA克隆低温胁迫

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石斑鱼遗传多样性及其系统发育分析

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安徽农业科学 2015年第29期43卷 75-79页

作者：李庆黄毅昌闫秀英简纪常吴灶和广东海洋大学广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室广东湛江524088

石斑鱼不仅是重要的海水经济鱼类,而且具有重要的生态地位。但是,石斑鱼的分类、物种多样性、资源保护及其合理开发等需要对石斑鱼系统发育的分析与研究。线粒体基因是研究石斑鱼系统进化的理想分子标记,因此获得了青石斑鱼***长度为1 0... 详细信息

石斑鱼不仅是重要的海水经济鱼类,而且具有重要的生态地位。但是,石斑鱼的分类、物种多样性、资源保护及其合理开发等需要对石斑鱼系统发育的分析与研究。线粒体基因是研究石斑鱼系统进化的理想分子标记,因此获得了青石斑鱼***长度为1 039bp的16S r DNA、tRNA-Leu和NA1部分序列,基于其及ND2、cyt b对石斑鱼系统发育进行了分析,结果表明石斑鱼遗传多样性与地域分布关系不大,不同系统树分析都表明同一石斑鱼物种的系统发生关系基本一致,石斑鱼种间亲缘关系较近。此外,也发现某些异种间亲缘关系比同种间亲缘关系近的现象。

关键词：石斑鱼遗传多样性系统发育

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卵形鲳鲹PPARα基因cDNA序列的克隆、组织表达及生物信息学分析

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广东海洋大学学报 2015年第4期35卷 1-9页

作者：方玲玲陈刚王忠良汤保贵张健东黄建盛周晖广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088

采用RACE-PCR 克隆卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptors-α,PPAR α）基因的cDNA 序列全长,并应用生物信息学方法分析其编码蛋白质的理化性质和结构特征.结果表明... 详细信息

采用RACE-PCR 克隆卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptors-α,PPAR α）基因的cDNA 序列全长,并应用生物信息学方法分析其编码蛋白质的理化性质和结构特征.结果表明：卵形鲳鲹PPAR α 基因（GenBank 登录号KP893147） cDNA 全长1 930 bp,开放阅读框（ORF）为1 425 bp,共编码474 个氨基酸,其编码的蛋白质为不稳定蛋白,无信号肽和跨膜结构,二级结构由α 螺旋、β转角、伸展片段和无规则卷曲组成,且α 螺旋占较大比例;预测显示,该蛋白有PPARs 基因家族典型的DNA 结合区（DBD）和配体结合区（LBD）;序列对比表明,卵形鲳鲹PPAR α 基因与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、花鲈（Lateolabrax japonicas）、大黄鱼（Larimichthys crocea）、金头鲷（Sparus aurata）、军曹鱼（Rachycentroncanadum）等有较高的同源性（81% - 89%）;蛋白系统进化树分析显示,在人（Homo sapiens）、鼠（Mus musculus）、鸭（Gallus gallus）、花鲈、大黄鱼、军曹鱼等动物中,卵形鲳鲹的PPAR α 蛋白与军曹鱼的进化关系最为密切（94%）,与人（68%）、鼠（68%）、鸭（67%）等的同源性较低.荧光定量分析显示,卵形鲳鲹PPAR α mRNA 在脑、肾脏、肠、脾脏等组织表达水平较高,其次是皮肤、肌肉,在心脏、肝脏中表达量较低.

关键词：卵形鲳鲹过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα) 基因克隆 cDNA末端快速扩增(RACE) 生物信息学组织表达

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照度对龙虎斑幼鱼行为活动的影响

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广东海洋大学学报 2015年第1期35卷 43-50页

作者：李国聪陈刚黄建盛张健东周晖施纲潘传豪汤保贵王忠良广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088

龙虎斑幼鱼在运输、转池、过筛等过程中存在应激严重、怕人畏光、食欲低下、抗逆力差、成活率低等问题。以体长5.64±0.16cm、体质量4.99±0.46 g的龙虎斑幼鱼为实验对象,于室内自制循环水养殖系统中研究幼鱼在0、50、100、200... 详细信息

龙虎斑幼鱼在运输、转池、过筛等过程中存在应激严重、怕人畏光、食欲低下、抗逆力差、成活率低等问题。以体长5.64±0.16cm、体质量4.99±0.46 g的龙虎斑幼鱼为实验对象,于室内自制循环水养殖系统中研究幼鱼在0、50、100、200、400、800、1 600、3 200 lx等8种照度下的日常行为及摄食状况,实验周期30 d。结果表明：0、50 lx照度组的幼鱼可快速（1 d）适应环境,状态自由,摄食积极;1 600、3 200 lx照度组适应性较差,长时间处于紧张应激状态,于低水层高密度集群;其余各照度组在10 d后达到完全适应状态。摄食水层随着照度的降低而升高,表现出较强的规律性：0 lx〉50 lx〉100 lx〉200 lx〉400 lx〉800 lx〉1 600 lx〉3 200 lx,且15 d前0、50 lx组的摄食水层高于1 600、3 200 lx照度组,差异有统计学意义（P〈0.05）;摄食水平0~800 lx照度组普遍优于1 600、3 200 lx照度组,且10 d前两者差异有统计学意义（P〈0.05）。

关键词：龙虎斑行为活动摄食水层照度

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卵形鲳鲹肉碱棕榈酰基转移酶Ⅰ全长cDNA序列的克隆及生物信息学分析

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广东海洋大学学报 2015年第3期35卷 7-15页

作者：方玲玲王忠良陈刚汤保贵张健东黄建盛周晖广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东海洋大学广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室广东湛江524088 广东海洋大学广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088

采用RACE-PCR克隆卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)肉碱棕榈酰基转移酶Ⅰ(carnitine palmitoyltransferaseⅠ,CPTⅠ)c DNA序列全长,并对其编码氨基酸进行生物信息学分析。结果表明,卵形鲳鲹CPTⅠ基因(Gen Bank登录号KP987456)c DNA序列全长2 841 bp,其开放阅读框(ORF)为2 363 bp,编码787个氨基酸,3'非编码区(URT)335 bp,5'非编码区142 bp;生物信息预测显示CPTⅠ基因编码的蛋白无信号肽序列,脂溶指数高达85.63,亲水性平均值(GRAVY)为-0.213,具有2个跨膜区螺旋,在第312和367氨基酸残基处存在N-糖基化位点,在19个丝氨酸(Ser)、9个苏氨酸(Thr)和14个酪氨酸(Tyr)残基上可能发生磷酸化;二级结构中α螺旋(Alpha helix)占比例最大,为40.66%;该蛋白亚细胞定位预测其主要分布于细胞质和线粒体中;分子系统进化分析显示,卵形鲳鲹CPTⅠ蛋白与花鲈(Lateolabrax japonicas)的同源性最高,达94%,与大黄鱼(Larimichthys crocea)、金鲷(Sparus aurata)的次之,均为93%,与人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)等的同源性较低(65%)。

关键词：卵形鲳鲹肉碱棕榈酰基转移酶I 基因克隆生物信息分析

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草鱼呼肠孤病毒096 vp4基因生物信息学分析及其在肾细胞中的表达

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广东海洋大学学报 2015年第4期35卷 56-62页

作者：闫秀英郭定利郑树城王雅谢吉国简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室广东湛江524088 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 北京市大兴区水产技术推广站北京102600

克隆得一株新分离病毒草鱼呼肠孤病毒(GCRV)096的长为1 981 bp的vp4基因,分析该基因的生物信息及其编码蛋白的特性。生物信息学分析表明,同一基因型GCRV分离株vp4基因间的差异不大,但不同基因型GCRV分离株vp4基因间却存在很大的差异。GC... 详细信息

克隆得一株新分离病毒草鱼呼肠孤病毒(GCRV)096的长为1 981 bp的vp4基因,分析该基因的生物信息及其编码蛋白的特性。生物信息学分析表明,同一基因型GCRV分离株vp4基因间的差异不大,但不同基因型GCRV分离株vp4基因间却存在很大的差异。GCRV 096 VP4蛋白含有多个功能位点、2个跨膜结构域及多个潜在的抗原决定簇。构建p EGFP-N3-VP4真核表达质粒,并转染至草鱼肾(Ctenopharyngodon idellus kidney,CIK)细胞中,经荧光显微镜观察和Western blot鉴定,表明GCRV 096 VP4融合蛋白在CIK细胞中得以成功表达。

关键词：草鱼呼肠孤病毒 vp4基因生物信息学真核表达

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急性氨氮胁迫对卵形鲳鲹呼吸代谢的影响

急性氨氮胁迫对卵形鲳鲹呼吸代谢的影响

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2015年全国海水养殖学术研讨会

作者：陈刚李金兰张健东黄建盛周晖王忠良广东海洋大学水产学院湛江524025 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524025 广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室湛江524025 广东海洋大学水产学院湛江524025

运用AQUARE SP间歇流水式呼吸仪,研究了在不同浓度氨氮急性胁迫下,卵形鲳鲹呼吸代谢的变化.试验设T0(对照)、T1、T2、T3四个组,各组平均氨氮浓度(TAN)分别为0.08、1.07、1.98、3.07mg/L(非离子氨NH3-N:0.00、0.05、0.09、0.15mg/L).结... 详细信息

运用AQUARE SP间歇流水式呼吸仪,研究了在不同浓度氨氮急性胁迫下,卵形鲳鲹呼吸代谢的变化.试验设T0(对照)、T1、T2、T3四个组,各组平均氨氮浓度(TAN)分别为0.08、1.07、1.98、3.07mg/L(非离子氨NH3-N:0.00、0.05、0.09、0.15mg/L).结果表明:随氨氮浓度升高,卵形鲳鲹耗氧率(M02)和代谢率(REO)先上升后达到稳定,而血氨(PA)及氧氮比(O∶N ratio)则持续上升,T2、T3组的上述指标显著高于对照组(P＜0.05);肝糖原(LG)呈下降趋势,从T1组开始就与对照组有显著差异(P＜0.05),而排氨率(RN)、氨商(AQ)、蛋白质供能比(PEP)则在氨氮超过1.07mg/L后呈下降趋势,其中T2、T3组显著低于对照组(P＜0.05);肝乳酸(LD)无明显变化趋势;相关性回归分析结果表明除LD外,其它呼吸代谢指标与氨氮浓度相关性较高.

关键词：卵形鲳鲹呼吸代谢氨氮浓度

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红罗非鱼Na^+-K^+-ATPase α基因的克隆及其在不同盐度条件下mRNA表达差异

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生物技术通报 2014年第3期30卷 137-145页

作者：王忠良张健东黄建盛汤保贵周晖施钢潘传豪吴灶和陈刚广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

为获知红罗非鱼(Oreochromis sp.)Na+-K+-ATPaseα基因的全长分子结构及其在不同盐度条件下的表达情况,采用同源克隆及cDNA末端快速扩增(RACE-PCR)方法,首次在红罗非鱼鳃组织中克隆到了全长为3 379 bp的Na+-K+-ATPaseα基因全长cDNA序列... 详细信息

为获知红罗非鱼(Oreochromis sp.)Na+-K+-ATPaseα基因的全长分子结构及其在不同盐度条件下的表达情况,采用同源克隆及cDNA末端快速扩增(RACE-PCR)方法,首次在红罗非鱼鳃组织中克隆到了全长为3 379 bp的Na+-K+-ATPaseα基因全长cDNA序列,该序列包含3 072 bp的开放阅读框(ORF),143 bp的5'末端非编码区(UTR)和164 bp的3'末端非编码区(UTR),编码1023个氨基酸,预测分子量为112.5 kD,理论等电点为5.26。BLAST分析显示红罗非鱼Na+-K+-ATPaseα基因编码的氨基酸序列与其它已知物种相应基因编码的氨基酸序列的同源性达到97%-99%;系统进化分析显示,红罗非鱼Na+-K+-ATPaseα亚基与萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)和莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)亲缘关系较近。应用Real-time PCR技术,以β-actin基因为内参,对不同盐度(0、15、25、32 g/L)条件下鳃组织中Na+-K+-ATPaseα基因的表达情况进行了比较分析,结果表明,当盐度为25 g/L时,Na+-K+-ATPaseα基因的表达量达到峰值,而盐度升至32 g/L时,其表达量呈下降趋势;各盐度处理组中,养殖12 h后Na+-K+-ATPaseα基因的mRNA表达量显著上升(P<0.05)并达到最高;随着养殖时间的延长,24 h后该基因mRNA表达量开始降低,但仍然显著高于对照组的表达量值(P<0.05)。

关键词：红罗非鱼 Na+-K+-ATPase α 基因 cDNA 末端快速扩增实时荧光定量 PCR

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