检索结果-内蒙古大学图书馆

生物技术通报 2021年第5期37卷 84-91页

作者：曾福源苏泽辉周诗慧谢妙庞欢瑛广东海洋大学深圳研究院深圳510000 广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

构建溶藻弧菌HY9901 PEPCK蛋白的原核表达载体、优化其表达条件,并鉴定该蛋白的乙酰化及琥珀酰化修饰。采用PCR克隆pepck基因,构建pET-28a-pepck并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌株的培养温度、IPTG浓度及时间进行优化,采用SDS-PAG... 详细信息

构建溶藻弧菌HY9901 PEPCK蛋白的原核表达载体、优化其表达条件,并鉴定该蛋白的乙酰化及琥珀酰化修饰。采用PCR克隆pepck基因,构建pET-28a-pepck并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌株的培养温度、IPTG浓度及时间进行优化,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达及乙酰化、琥珀酰化修饰。结果显示,pepck基因全长1 629 bp,重组菌株可以正确表达分子质量约60.9 kD的蛋白。诱导温度:在28℃条件下PEPCK存在于上清和包涵体中,在37℃则主要以包涵体形式存在;IPTG浓度:0.2 mmol/L-1.0 mmol/L范围内,PEPCK的表达量无明显差异;时间:在0-8 h内PEPCK表达量随时间增长逐渐增加,诱导8 h后趋于稳定。Western blot显示PEPCK蛋白具有乙酰化修饰和琥珀酰化修饰。成功构建溶藻弧菌PEPCK重组表达菌株,其最优诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG,28℃诱导8 h;经鉴定PEPCK蛋白具有乙酰化修饰和琥珀酰化修饰。

关键词：溶藻弧菌 PEPCK蛋白原核表达乙酰化琥珀酰化

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溶藻弧菌T3SS exsD基因敲除突变株构建及其表型特征

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广东海洋大学学报 2021年第5期41卷 35-43页

作者：王俊霖招茵苏茵茵周诗慧曾福源谢妙王娜简纪常庞欢瑛广东海洋大学水产学院/广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 中国检验检疫科学研究院北京100176

【目的】构建溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)中的调控蛋白操纵子ExsD基因缺失株,研究exsD缺失株表型特征。【方法】采用overlapPCR技术构建缺失株ΔexsD,PCR检测缺失株ΔexsD的遗传稳定性... 详细信息

【目的】构建溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)中的调控蛋白操纵子ExsD基因缺失株,研究exsD缺失株表型特征。【方法】采用overlapPCR技术构建缺失株ΔexsD,PCR检测缺失株ΔexsD的遗传稳定性,比较缺失株与野生株之间的生长速度、泳动能力、胞外酶活性、药物敏感性、毒力,分别采用结晶紫和共聚焦电镜方法测定生物膜的差异变化,通过qRT-PCR方法分析exsD的缺失对T3SS效应蛋白Hop转录的影响。【结果】缺失株ΔexsD构建成功;与野生株相比,ΔexsD遗传稳定性和生长速度无显著差别,但泳动能力极显著上升(P <0.01),胞外蛋白酶活性显著上升(P <0.05),形成生物膜能力在24 h时提高(P <0.05);相比野生株,ΔexsD对米诺环素、庆大霉素、卡那霉素、多西环素、新霉素的敏感性从耐药变成中度敏感;ΔexsD缺失株的毒力显著上升,野生株对斑马鱼的半数致死剂量是缺失株的3.68倍。实时荧光定量结果显示,与HY9901野生型相比,exsD基因的缺失增加了效应蛋白Hop的转录表达。【结论】exsD基因对T3SS的致病性起负调控作用,为进一步阐明exsD基因在溶藻弧菌中的作用机理提供一定的理论基础。

关键词：溶藻弧菌 Ⅲ型分泌系统 exsD基因基因敲除缺失株表型特征

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斜阳岛珊瑚礁区海泥可培养细菌的分离鉴定及其ECP抑菌作用

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基因组学与应用生物学 2020年第2期39卷 644-651页

作者：周诗慧吴志豪廖嘉明庞欢瑛鲁义善广东海洋大学深圳研究院深圳510000 广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

为探究斜阳岛珊瑚礁区海洋微生物的代谢产物活性,为天然材料制备新药物资源的开发提供一定的理论依据和实践指导,本研究从斜阳岛珊瑚礁区海泥分离纯化得到3株菌株,经鉴定分别为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、Sphingopyxis terrae和Fic... 详细信息

为探究斜阳岛珊瑚礁区海洋微生物的代谢产物活性,为天然材料制备新药物资源的开发提供一定的理论依据和实践指导,本研究从斜阳岛珊瑚礁区海泥分离纯化得到3株菌株,经鉴定分别为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、Sphingopyxis terrae和Fictibacillus phosphorivorans,分别培养并提取3株细菌的胞外产物(extracellular products,ECP),与硝酸银制备成生物纳米银,OD法测定其抑菌(溶藻弧菌)动力曲线,用2倍稀释法测出3株菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别是21.2μg/mL、18.8μg/mL、20.0μg/mL,用牛津杯法分别测定了3株菌与溶藻弧菌的抑菌活性,抑菌直径分别是(12.20±0.18)mm、(1.32±0.12)mm、(10.81±0.15)mm,安全性实验表明此3株菌对鱼体是安全的。本实验对斜阳岛珊瑚礁区海泥中可培养细菌进行了初步分离与鉴定,并利用分离菌的胞外产物合成生物纳米银,结果显示其具有一定的抑菌效果,从而证明其具有开发新的天然防腐剂和新药的潜力。

关键词：珊瑚礁溶藻弧菌分离鉴定抑菌作用生物纳米银

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湛江卵形鲳鲹致病链球菌的分离、鉴定及药敏实验

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基因组学与应用生物学 2019年第12期38卷 5403-5411页

作者：武沛文宋大伟郭丹玲庞欢瑛汤菊芬简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

为了确定2017年6月至2017年9月湛江市太平镇网箱养殖卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)疑似发生鱼链球菌病的病原菌及其毒力特性,取病鱼的脑、肝脏、脾脏和肾脏在血平板上进行分离培养,将分离培养的病原菌对卵形鲳鲹进行人工回归感染实验,... 详细信息

为了确定2017年6月至2017年9月湛江市太平镇网箱养殖卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)疑似发生鱼链球菌病的病原菌及其毒力特性,取病鱼的脑、肝脏、脾脏和肾脏在血平板上进行分离培养,将分离培养的病原菌对卵形鲳鲹进行人工回归感染实验,试验鱼呈现自然发病症状:游泳异常、眼球突出且浑浊、鳍条基部充血,证明分离菌为卵形鲳鲹爆发性流行病的致病菌。通过形态学观察、生化鉴定、16S rRNA序列分析,结果表明,分离的致病菌为海豚链球菌(Streptococcus iniae),暂定为中国湛江株GHZ007(GenBank:KX788919),其对卵形鲳鲹的LD50为2.42×106CFU/mL。药敏实验结果表明,分离菌株对四环素类和氨基糖苷类药物等17种试验药物敏感,对青霉素、复方新诺明等8种试验药物有耐药性。本研究将有助于为海豚链球菌病的防治提供理论基础。

关键词：卵形鲳鲹海豚链球菌 16S rRNA 药敏实验

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溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统C-环组分VscQ的原核表达及免疫原性

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安徽农学通报 2020年第18期26卷 101-105页

作者：曾福源伍艳清邱明生武沛文周诗慧王俊霖简纪常谢妙庞欢瑛广东海洋大学深圳研究院广东深圳510000 广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088

为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901菌株Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)胞质环(C-环)组分VscQ作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌vscQ序列(***862753),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscQ基因,进行序列分析。结果显示,该基因全长969bp,预计分子量35.61kDa。将vscQ基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEXvscQ。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,能在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为61.6kDa的VscQ融合蛋白。VscQ蛋白表达的最优条件为:0.4mmol/L IPTG,15℃条件下诱导12h。用纯化后的VscQ融合蛋白免疫白兔,获得高效多克隆抗体,抗体效价为1∶121500。兔抗VscQ血清能与重组VscQ蛋白发生特异性反应,表明T3SS C-环组分VscQ可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。

关键词：溶藻弧菌 VscQ Ⅲ型分泌系统原核表达免疫原性

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β-葡聚糖刺激下的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)转录组分析

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基因组学与应用生物学 2018年第1期37卷 219-228页

作者：张海艳鲁义善汪志文王蓓黄瑜简纪常广东海洋大学湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）是一种重要的海水经济养殖鱼类,然而病害是制约其养殖产量的一个重要因素。近年来-葡聚糖作为一种新型的天然免疫增强剂在水产养殖业中得到广泛应用。本研究采用腹腔注射0.2 mL-葡聚糖（浓度0.05 g/m... 详细信息

斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）是一种重要的海水经济养殖鱼类,然而病害是制约其养殖产量的一个重要因素。近年来-葡聚糖作为一种新型的天然免疫增强剂在水产养殖业中得到广泛应用。本研究采用腹腔注射0.2 mL-葡聚糖（浓度0.05 g/mL）刺激斜带石斑鱼,在刺激6 h、72 h后分别取头肾、血液淋巴细胞、胸腺和脾脏组织进行转录测序。结果一共组装了175 568条unigene,平均长度是1 507 bp。通过Blast比对数据库进行功能注释,一共注释了121 629条unigene。六大数据库注释得到的unigene数量分别为：91 955条（Nt）、66 089条（Nr）、14 126条（GO）、24 018条（COG）、9 673条（KEGG）和54 148条（Swiss Prot）。根据基因差异表达分析筛选出6类免疫相关的显著性差异基因71个,涉及抗原加工呈递、细胞粘附分子、补体系统、细胞因子、模式识别受体和吞噬作用。对差异基因进行GO富集分析,筛选出免疫相关条目7条,包括免疫应答、B细胞受体信号通路、趋化因子受体活性、白细胞趋化性、趋化因子调节信号通路、白细胞介素-1受体绑定和溶酶体组份。随机挑选7个显著性差异的免疫基因进行qRT-PCR验证,验证结果与测序结果变化趋势一致。本实验结果为研究-葡聚糖调节鱼类免疫系统的作用机制提供数据参考。

关键词：斜带石斑鱼 β-葡聚糖转录组 qRT-PCR

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尼罗罗非鱼NCC活性调控蛋白的筛选鉴定与功能分析

尼罗罗非鱼NCC活性调控蛋白的筛选鉴定与功能分析

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2018年中国水产学会学术年会

作者：黄瑜汤菊芬蔡佳王蓓鲁义善简纪常广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室

非特异性细胞毒性细胞Ⅰ型受体(NCCRP-1)是非特异性细胞毒性细胞(NCC)发挥功能的重要受体蛋白。本研究以罗非鱼为研究对象,构建On-NCCRP-1酵母双杂交诱饵质粒,并构建罗非鱼头肾与肝脏酵母双杂交c DNA文库。利用诱饵载体分别从肝脏和头肾... 详细信息

非特异性细胞毒性细胞Ⅰ型受体(NCCRP-1)是非特异性细胞毒性细胞(NCC)发挥功能的重要受体蛋白。本研究以罗非鱼为研究对象,构建On-NCCRP-1酵母双杂交诱饵质粒,并构建罗非鱼头肾与肝脏酵母双杂交c DNA文库。利用诱饵载体分别从肝脏和头肾c DNA文库中筛选潜在互作蛋白。最终获取C-typelectin(On-C-typelectin)蛋白与On-NCCRP-1有潜在相互作用,并且克隆获得On-C-typelectin基因的ORF序列。点对点验证发现On-NCCRP-1与On-C-typelectin可相互作用。利用On-C-typelectin重组蛋白对体外分离的NCC进行刺激后,发现3 h和6 h均可诱导部分NCC毒性效应分子高表达,该结果表明NCC被激活。同时用诱导3 h的NCC对FHM细胞进行毒性实验,发现On-C-type lectin重组蛋白可有效诱导FHM细胞凋亡信号开启,而使用抗On-NCCRP-1抗体封闭On-NCCRP-1,可抑制NCC对FHM的杀伤活性。结果表明,On-C-type lectin可通过受体On-NCCRP-1介导NCC的杀伤活性。该研究为揭示鱼类NCC活性调控的作用网络及分子机理奠定了基础。

关键词：尼罗罗非鱼非特异性细胞毒性细胞非特异性细胞毒性细胞Ⅰ型受体 C-type lectin 活性调控

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尼罗罗非鱼NITR基因的克隆鉴定与组织表达分析

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生物技术通报 2017年第5期33卷 145-152页

作者：汪志文黄瑜张海艳汤菊芬简纪常鲁义善广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

从尼罗罗非鱼脾脏组织中克隆获得新型免疫受体(NITR,Novel immune-type receptor)基因的编码区序列(Gen Bank登录号:KX989509;命名为On-NITR),该基因c DNA全长1 119 bp,ORF为1 026 bp,可编码341个氨基酸,理论分子量为37.38k D,等电点为8.28。通过NCBI BLAST比对发现罗非鱼NITR与其他已报道的物种NITR氨基酸序列相似度为27%-46%。氨基酸序列分析显示:On-NITR具有1个信号肽区域、2个胞外Ig-domain区、1个跨膜结构域,以及1个胞质尾区,该胞质尾区含有NITR典型的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和一个ITIM类似基序itim,且具有较高的保守性。荧光定量PCR分析显示,On-NITR在健康尼罗罗非鱼组织中均有表达,在肠道、皮肤、肝脏表达水平较高,在胸腺、鳃、脾脏、心脏、脑组织中的表达量较低,在头肾组织中的表达量最低。

关键词：尼罗罗非鱼 NITR蛋白基因克隆组织表达分析

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鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因的克隆及亚细胞定位研究

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生物技术通报 2017年第5期33卷 219-226页

作者：夏立群陈锐敏廖保山徐亮苏泽杰童邦卓广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,为兼性胞内菌。生物信息学分析显示鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因的表达产物为分泌蛋白,且可能定位于宿主细胞的线粒体上。通过构建重组质粒p EGFP-DmpA和pc DNA-DmpA、鰤鱼诺卡氏... 详细信息

鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,为兼性胞内菌。生物信息学分析显示鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因的表达产物为分泌蛋白,且可能定位于宿主细胞的线粒体上。通过构建重组质粒p EGFP-DmpA和pc DNA-DmpA、鰤鱼诺卡氏菌胞外产物鉴定、亚细胞定位、过表达等方法,对鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因进行了克隆、亚细胞定位及初步功能研究。结果表明在鰤鱼诺卡氏菌胞外产物中鉴定到了DmpA蛋白,证实其为分泌蛋白。亚细胞定位研究发现DmpA-GFP融合蛋白均匀地分布在FHM细胞中,与线粒体分布不重合,说明DmpA蛋白并不定位在线粒体上。DmpA-GFP融合蛋白的表达会改变FHM细胞线粒体的分布为团块状。DmpA在细胞中的过量表达对细胞核无明显影响,表明该基因无诱导细胞凋亡的功能。通过对鰤鱼诺卡氏菌DmpA的克隆、亚细胞定位和过表达研究,为进一步研究该基因的功能和深入了解鰤鱼诺卡氏菌的致病机理奠定了基础。

关键词：鰤鱼诺卡氏菌 DmpA基因分泌蛋白亚细胞定位

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罗非鱼无乳链球菌传播途径与逃避宿主免疫防御策略

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广东农业科学 2017年第7期44卷 132-140页

作者：黎源王蓓汪志文蔡小辉汤菊芬鲁义善简纪常广东海洋大学水产学院/广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088

罗非鱼是我国重要的养殖鱼类之一,近年来频繁暴发的链球菌病严重影响了我国罗非鱼养殖业的健康发展。无乳链球菌是罗非鱼链球菌病的主要病原之一,阐明其感染机制和免疫逃避机制,对预防与治疗该病至关重要。对鱼源无乳链球菌的侵染途径... 详细信息

罗非鱼是我国重要的养殖鱼类之一,近年来频繁暴发的链球菌病严重影响了我国罗非鱼养殖业的健康发展。无乳链球菌是罗非鱼链球菌病的主要病原之一,阐明其感染机制和免疫逃避机制,对预防与治疗该病至关重要。对鱼源无乳链球菌的侵染途径、肠道的定植策略以及逃避宿主免疫监视机制等方面的研究成果进行综述,为深入研究无乳链球菌与宿主之间的相互作用提供参考,为罗非鱼链球菌病的综合防控奠定理论基础。

关键词：罗非鱼无乳链球菌传播途径肠道定植免疫逃避

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