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中国水产学会鱼病专业委员会2015年学术讨论会

作者：邱明生庞欢瑛蔡双虎闫秀英简纪常鲁义善吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

HopPmaJ 基因是溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统中的一个效应蛋白，为探究该基因对溶藻弧菌HY9901 生物学特性的影响，本实验克隆了溶藻弧菌HY9901株Ⅲ型效应因子HopPmaJ 的全长基因，采用Overlap PCR 以及同源重组技术，通过正负向筛选标记，构... 详细信息

HopPmaJ 基因是溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统中的一个效应蛋白，为探究该基因对溶藻弧菌HY9901 生物学特性的影响，本实验克隆了溶藻弧菌HY9901株Ⅲ型效应因子HopPmaJ 的全长基因，采用Overlap PCR 以及同源重组技术，通过正负向筛选标记，构建一株无标记基因框内敲除缺失株，用生物学功能实验研究比较HopPmaJ 基因突变株与野生株HY9901 在生长速率、胞外蛋白酶活性以及致病机理等方面的差异。

关键词：溶藻弧菌 HopPmaJ Ⅲ型效应因子基因敲除克隆

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无乳链球菌sRNA的预测及鉴定

无乳链球菌sRNA的预测及鉴定

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中国水产学会鱼病专业委员会2015年学术讨论会

作者：王松艳蔡双虎简纪常鲁义善吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 广东省水产动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

sRNA(small RNA)在许多细菌中是重要的调控分子，它可能与细菌的新陈代谢，适应性和毒力性调控存在复杂的关系.为研究sRNA 在无乳链球菌毒力调控中的作用，在本研究中，对无乳链球菌强毒株进行全基因组测序并应用sRNA predict2 对其sRNA... 详细信息

sRNA(small RNA)在许多细菌中是重要的调控分子，它可能与细菌的新陈代谢，适应性和毒力性调控存在复杂的关系.为研究sRNA 在无乳链球菌毒力调控中的作用，在本研究中，对无乳链球菌强毒株进行全基因组测序并应用sRNA predict2 对其sRNA 进行预测，共获得了34 条候选sRNA.

关键词：无乳链球菌 sRNA 预测鉴定

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溶藻弧菌减毒活疫苗的构建及其免疫保护性

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中国水产科学 2014年第4期21卷 769-776页

作者：庞欢瑛周泽军丁燏闫秀英蔡双虎简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

采用Overlap PCR和同源重组技术,结合氯霉素(Cm)正向筛选和sacB基因蔗糖负向筛选,构建了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白vscO基因无标记框内缺失突变株ZJ03ΔvscO。在以石斑鱼... 详细信息

采用Overlap PCR和同源重组技术,结合氯霉素(Cm)正向筛选和sacB基因蔗糖负向筛选,构建了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白vscO基因无标记框内缺失突变株ZJ03ΔvscO。在以石斑鱼(Epinephelus coioides)为模型的感染实验中发现ZJ03ΔvscO的毒力较ZJ03下降约150倍。将ZJ03ΔvscO作为减毒活疫苗通过注射、浸泡的途径免疫石斑鱼(Epinephelus coioides)后,发现其对溶藻弧菌有很好的保护效应,其中注射组的免疫保护率达84%,浸泡组次之(68%)。血清效价分析显示,免疫后第4周注射组和浸泡组的效价均达到最高值,分别为1:2 048和1︰128。上述结果表明,所构建的ZJ03ΔvscO减毒活疫苗可有效提高石斑鱼对溶藻弧菌的免疫力,并且免疫和攻毒的途径可能是影响免疫保护效果的因子。本研究旨在为溶藻弧菌引起的鱼类疾病防治提供技术支撑。

关键词：溶藻弧菌 vscO 减毒活疫苗免疫保护

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溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣护航蛋白VscO的基因克隆及其生物信息学分析

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生物技术通报 2014年第6期30卷 155-161页

作者：庞欢瑛周泽军丁燏黄郁葱吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

克隆了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(T3SS)分子伴侣护航蛋白(Chaperone escort protein)vscO基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,vscO基因全长462 bp,编码153个氨基酸,理论分子量约为18.43 kD,pI值为9.22。细胞定位分析显示vscO基因位于外周质,不存在信号肽,无跨膜区。vscO基因具有转录起始区-35区和-10区,以及翻译识别信号SD序列(Shine-Dalgarno sequence)。该氨基酸序列含有多种活性位点,如蛋白激酶C磷酸化位点等。系统进化树发现溶藻弧菌的VscO蛋白与副溶血弧菌聚为同一亚族。VscO亚基三维结构模型显示其与副溶血弧菌T3SS的YscO蛋白有相似构型。信号通路分析推测VscO位于T3SS的针状样结构上。蛋白网络互作图谱发现VscO与10种T3SS蛋白具有相邻关系。本研究结果将为溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统护航机制的研究奠定基础。

关键词：溶藻弧菌 Ⅲ型分泌系统(T3SS) 分子伴侣护航vscO基因

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溶藻弧菌dldh基因突变株的构建及其生物学功能研究

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生物技术通报 2014年第10期30卷 161-167页

作者：庞欢瑛陈立明黄郁葱简纪常鲁义善吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

为揭示二氢硫辛酰胺脱氢酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,DLDH)在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)致病中的作用,以pRE112自杀质粒为载体,应用插入失活突变法构建dldh基因插入突变株,比较分析了野生株ZJ03与缺失株ZJ03Δdldh在生长、... 详细信息

为揭示二氢硫辛酰胺脱氢酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,DLDH)在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)致病中的作用,以pRE112自杀质粒为载体,应用插入失活突变法构建dldh基因插入突变株,比较分析了野生株ZJ03与缺失株ZJ03Δdldh在生长、泳动能力、酶活性、生物膜形成、致病性的表现。结果表明,dldh基因的突变,使溶藻弧菌生长的迟缓期延长、泳动能力显著减弱(P<0.05),酶活性显著降低(P<0.05),生物膜生成显著减少(P<0.05),对石斑鱼(Epinephelus coioides)的致病性也明显减弱(P<0.05)。本研究为从细菌能量代谢角度研究弧菌的致病机制提供理论依据。

关键词：溶藻弧菌 dldh缺失株生物特性

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红笛鲷p38β MAPK基因的克隆及原核表达

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生物技术通报 2014年第12期30卷 177-183页

作者：夏洪丽蔡佳鲁义善简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

鱼类p38 MAPK基因在宿主免疫调控及抵御病原侵染的过程中具有重要作用。利用RACE技术克隆了红笛鲷p38βMAPK基因(Ls-p38β,Gen Bank登录号为KJ502277)。序列分析结果显示,Ls-p38βc DNA全长1 628 bp,开放阅读框1 086 bp,可编码361个氨基... 详细信息

鱼类p38 MAPK基因在宿主免疫调控及抵御病原侵染的过程中具有重要作用。利用RACE技术克隆了红笛鲷p38βMAPK基因(Ls-p38β,Gen Bank登录号为KJ502277)。序列分析结果显示,Ls-p38βc DNA全长1 628 bp,开放阅读框1 086 bp,可编码361个氨基酸,预测其编码蛋白的分子量为41.6 k D,理论等电点为5.74。该基因推导的氨基酸序列含有p38 MAPK家族保守的双磷酸化激活环(TGY),与尼罗罗非鱼的p38β有97%的相似性。将此基因定向插入原核表达载体构建重组表达质粒p ET32-p38β后导入BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE与Western blot分析显示约在60 k D出现特异蛋白条带,与预期分子量大小相符,说明Ls-p38β融合蛋白表达成功。

关键词：红笛鲷 p38β 丝裂原活化蛋白激酶原核表达

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鱼类致病杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)特异性PCR检测方法的建立

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广东海洋大学学报 2014年第4期34卷 56-61页

作者：夏洪丽鲁义善汤菊芬蔡佳汪美夏立群广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088

鱼类诺卡氏菌病是全球性的鱼病,杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)是引起鱼类诺卡氏菌病的主要病原之一。根据杀鲑诺卡氏菌16S-23S转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立特异性PCR检测杀鲑诺卡氏菌的方法。结果表明,筛选的PCR引物可特异... 详细信息

鱼类诺卡氏菌病是全球性的鱼病,杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)是引起鱼类诺卡氏菌病的主要病原之一。根据杀鲑诺卡氏菌16S-23S转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立特异性PCR检测杀鲑诺卡氏菌的方法。结果表明,筛选的PCR引物可特异性地扩增出杀鲑诺卡氏菌的ITS片段,检测灵敏度(DNA浓度)为28.3 pg·μL-1。检测人工感染杀鲑诺卡氏菌的鱼组织,结果显示,该方法可从未分离到病原菌的病鱼组织中检出阳性片段,较传统细菌分离鉴定方法更为高效灵敏。

关键词：杀鲑诺卡氏菌转录间隔区聚合酶链式反应检测

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溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化

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广东海洋大学学报 2014年第3期34卷 52-57页

作者：陈立明庞欢瑛简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东海洋大学广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温... 详细信息

根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温度、诱导时间、诱导IPTG浓度等条件的优化,最后探究其纯化时最佳咪唑洗脱浓度。结果表明:DTD蛋白成功表达,且其以包涵体的形式存在,在诱导温度37℃、IPTG浓度0.1 mmol/L条件下诱导5 h表达量最高,纯化最佳咪唑洗脱浓度为150 mmol/L。

关键词：溶藻弧菌 dtd 基因克隆原核表达条件优化

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溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统注射装置蛋白VscO的原核表达及免疫原性

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广东海洋大学学报 2014年第3期34卷 41-46页

作者：庞欢瑛周泽军丁燏黄郁葱吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院广东海洋大学广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白VscO作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌VscO序列(***179947),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscO基因,序列分析结果显示,该基因全长462 bp,理论分子质量为18.430ku。将vscO基因定向插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-vscO。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为22 ku的VscO融合蛋白,且该蛋白主要以包涵体形式存在。VscO蛋白表达和纯化的最优条件为:0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4 h,咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,获得高效多克隆抗体。Western-blotting结果表明,鼠抗VscO血清既能与重组VscO蛋白发生反应,也能与分离自溶藻弧菌约22 ku的天然蛋白发生反应,提示T3SS注射装置蛋白VscO可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。

关键词：溶藻弧菌 vscO基因 Ⅲ型分泌系统原核表达免疫原性

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大黄和公丁香对致病性哈氏弧菌及其生物膜的体外抑制作用

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安徽农业科学 2014年第24期42卷 8188-8190,8202页

作者：黎家勤庞欢瑛简纪常汤菊芬广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088

[目的]观察大黄(Rheum officinale)和公丁香(Flos caryophylli)对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)及其生物膜(Biofilm)的体外抑制作用。[方法]采用琼脂扩散法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌的体外抑菌作用;采用倍比稀释法测定大黄和公丁香对哈氏... 详细信息

[目的]观察大黄(Rheum officinale)和公丁香(Flos caryophylli)对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)及其生物膜(Biofilm)的体外抑制作用。[方法]采用琼脂扩散法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌的体外抑菌作用;采用倍比稀释法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);采用MTT法评价2种中草药液对哈氏弧菌生物膜形成的影响。[结果]大黄对哈氏弧菌的抑菌圈直径为(15.31±0.4)mm,MIC和MBC均为7.813 mg/ml;公丁香对哈氏弧菌的抑菌圈直径为(11.53±0.6)mm,MIC和MBC分别为15.625和62.5 mg/ml;2种中草药液浓度分别在7.81和0.97 mg/ml以上时对生物膜的形成有极显著抑制作用(P<0.01)。[结论]大黄和公丁香对哈氏弧菌及其生物膜均有明显抑制作用,其中大黄的作用比公丁香更强。

关键词：大黄公丁香哈氏弧菌生物膜体外抑制作用

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