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广东海洋大学学报 2016年第6期36卷 33-37页

作者：汤菊芬蔡佳黄瑜廖建萌黄月雄简纪常广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 湛江市食品药品检测所广东湛江524022

在水温(28±2)℃、盐度28条件下,将盐酸氯苯胍(Robenidine hydrochloride,ROBH)按30 mg/kg的剂量口灌红笛鲷(Luthjanus sanguineus),用HPLC-MS/MS法研究ROBH在红笛鲷体内的药代动力学和残留消除规律。结果表明:单剂量口灌给药后,红... 详细信息

在水温(28±2)℃、盐度28条件下,将盐酸氯苯胍(Robenidine hydrochloride,ROBH)按30 mg/kg的剂量口灌红笛鲷(Luthjanus sanguineus),用HPLC-MS/MS法研究ROBH在红笛鲷体内的药代动力学和残留消除规律。结果表明:单剂量口灌给药后,红笛鲷血浆中ROBH的药时数据符合一级吸收二室模型,药物在血浆中的达峰时间t_p为1.79 h,血药浓度峰值C_(max)为211.38μg/L,药时曲线下面积(AUC_(0-∞))为5 229.16μg/(L·h),消除半衰期(t1/2β)为46.99 h。ROBH在红笛鲷其他组织中分布较广,消除速度较慢,肌肉、肝脏和肾脏的C_(max)分别为37.58、863.02、1 063.24μg/kg,t_p均为1.5 h,AUC0-∞分别1 017.03、20 841.20、30 743.04μg/(kg·h);t1/2β分别为26.35、14.05和24.31 h。连续5 d口灌给药后,红笛鲷血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的药物消除半衰期t1/2分别为46.14、36.11、28.62、26.92 h。以10μg/kg为最高残留限量,肌肉作为食用靶组织,在本试验条件下,建议休药期不少于7 d。

关键词：盐酸氯苯胍红笛鲷药代动力学药物残留消除

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斜带石斑鱼BCL2家族蛋白BOK基因鉴定与功能分析

斜带石斑鱼BCL2家族蛋白BOK基因鉴定与功能分析

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2016年中国水产学会学术年会

作者：蔡佳喻大鹏魏世娜汤菊芬鲁义善吴灶和秦启伟简纪常广东海洋大学广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室中国科学院南海海洋研究所中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室

细胞凋亡在许多生理过程和免疫应答中发挥着重要的作用,BOK基因是细胞凋亡中一个关键的调控因子。本研究对斜带石斑鱼BOK(Ec-BOK)基因进行了克隆及功能分析。结果表明,Ec-BOK基因可以编码210个氨基酸,其含有4个保守的功能结构域(BH1-4)... 详细信息

细胞凋亡在许多生理过程和免疫应答中发挥着重要的作用,BOK基因是细胞凋亡中一个关键的调控因子。本研究对斜带石斑鱼BOK(Ec-BOK)基因进行了克隆及功能分析。结果表明,Ec-BOK基因可以编码210个氨基酸,其含有4个保守的功能结构域(BH1-4)和1个跨膜区(TM),蛋白序列与深裂眶锯雀鲷该蛋白相似度最高,为97%。荧光定量分析表明Ec-BOK基因在多种组织中均有表达,其中肝脏和肾脏中表达量最高。经SGIV感染后,Ec-BOK基因表达上调,体外实验过表达Ec-BOK基因可以抑制病毒基因的转录。本研究结果表明,Ec-BOK基因在鱼类抗病毒免疫应答中可能发挥着重要作用

关键词：斜带石斑鱼 BOK 新加坡虹彩病毒(SGIV) 病毒基因病毒复制

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溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗的构建及其免疫效果评价

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水产学报 2015年第10期39卷 1558-1568页

作者：张燕飞庞欢瑛简纪常鲁义善汤菊芬吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室肇庆市水产技术推广中心仲恺农业工程学院

为了研究溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗对鱼体的免疫保护作用,本研究采用OverlapPCR和同源重组技术,构建了kdpD/kdpE(kdpDE)基因无标记基因框内敲除突变株。对野生株和缺失突变株的生物学特性及致病性进行了比较研究,发现kdpD... 详细信息

为了研究溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗对鱼体的免疫保护作用,本研究采用OverlapPCR和同源重组技术,构建了kdpD/kdpE(kdpDE)基因无标记基因框内敲除突变株。对野生株和缺失突变株的生物学特性及致病性进行了比较研究,发现kdpDE的缺失对溶藻弧菌的生长速率和胞外蛋白酶活性的影响不明显,但是突变株的泳动能力、生物被膜形成能力较野生株下降。斑马鱼致病性实验结果显示,突变株毒力下降78.5倍,表明减毒株构建成功,可以作为减毒活疫苗的候选菌株。突变株在鱼体内存活能力实验结果显示,注射免疫7d后,鱼体内未检测到该菌。以突变株ΔkdpDE为抗原,分别用注射和浸泡的方式免疫斑马鱼,免疫后第28天用溶藻弧菌和哈维氏弧菌攻毒,评估该疫苗候选株及不同免疫方式对斑马鱼的保护效果。实验结果表明,免疫后的斑马鱼能够抵抗溶藻弧菌的感染,其中注射免疫组的免疫保护率达83.3%,浸泡免疫组次之(66.7%);同时,该减毒活疫苗能刺激斑马鱼对哈维氏弧菌产生交叉保护效应,其中注射免疫组的免疫保护率为65.5%,浸泡免疫组为55.2%。以上结果表明,kdpDE基因敲除突变株可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效候选减毒活疫苗。

关键词：溶藻弧菌 Kdp DE 减毒活疫苗斑马鱼免疫保护率

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溶藻弧菌kdpD基因敲除突变株的构建及其表型特征

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微生物学通报 2015年第9期42卷 1770-1778页

作者：张燕飞庞欢瑛简纪常鲁义善吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

【目的】探究kdpD基因对溶藻弧菌生物学特性的影响。【方法】采用Overlap PCR和同源重组技术,结合正负向筛选,构建kdpD基因无标记基因框内敲除突变株,比较kdpD突变株和野生株HY9901在生长速率、胞外蛋白酶活性以及毒力等方面的差异。【... 详细信息

【目的】探究kdpD基因对溶藻弧菌生物学特性的影响。【方法】采用Overlap PCR和同源重组技术,结合正负向筛选,构建kdpD基因无标记基因框内敲除突变株,比较kdpD突变株和野生株HY9901在生长速率、胞外蛋白酶活性以及毒力等方面的差异。【结果】成功构建溶藻弧菌kdpD基因敲除突变株。体外实验表明,kdpD的缺失对溶藻弧菌的生长曲线和胞外蛋白酶活性的影响不明显,但是突变株的泳动能力和生物被膜形成能力出现下降。斑马鱼致病性试验结果显示,突变株毒力下降了8.84倍。【结论】kdpD基因参与调控溶藻弧菌的泳动能力、被膜形成和毒力,但不影响生长速率和胞外蛋白酶活性。

关键词：溶藻弧菌 kdp D 基因敲除表型

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斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)MHC Ⅱα基因的克隆及表达分析

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高技术通讯 2015年第1期25卷 102-110页

作者：蔡佳李楠蒋一男张念之鲁义善吴灶和夏春简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 中国农业大学动物医学院北京100094

利用RACE PCR克隆了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)主要组织相容性复合体Ⅱα(MHCⅡα)基因,并通过荧光定量PCR分析了该基因在健康鱼体中的组织分布以及在溶藻弧菌(Vibro alginolyticus)感染后在不同组织中的表达变化。斜带石斑鱼MH... 详细信息

利用RACE PCR克隆了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)主要组织相容性复合体Ⅱα(MHCⅡα)基因,并通过荧光定量PCR分析了该基因在健康鱼体中的组织分布以及在溶藻弧菌(Vibro alginolyticus)感染后在不同组织中的表达变化。斜带石斑鱼MHCⅡαcDNA全长为2127bp,其中5'非翻译区为834bp,开放阅读框为714bp,3'非翻译区为579bp,编码237个氨基酸,其推导的氨基酸序列包含信号肽、α1及α2功能区、跨膜区、连接肽和胞浆区。荧光定量PCR结果表明,斜带石斑鱼MHCⅡα基因在鳃、头肾、肝、体肾、脑、脾和肠中表达量较高,在心脏、皮肤和肌肉中的表达量较低,并且溶藻弧菌(Vibro alginolyticus)感染后在脾、肠、头肾、和体肾中的表达显著上调,分别为对照组的9.5倍、4.3倍、3.4倍及1.9倍。上述结果表明斜带石斑鱼MHCⅡα在抗溶藻弧菌感染的免疫反应中可能发挥重要作用,这对进一步了解石斑鱼抗菌免疫反应具有参考意义。

关键词：斜带石斑鱼溶藻弧菌 MHC Ⅱα 克隆表达分析

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溶藻弧菌hutB基因的克隆及其在不同铁源下的表达分析

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上海海洋大学学报 2015年第2期24卷 190-195页

作者：庞欢瑛薛丽丽简纪常蔡双虎鲁义善吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

根据已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)血红素结合蛋白(Periplasmic Hemin-Binding Protein,HutB)基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的hutB基因,序列分析结果显示该基因全长870 bp,共编码289个氨基酸,分子量约为30.59 ku,PI为6.45。细胞定位、SignalP4.0、TMHMM Server 2.0和SoftB erry-Psite预测结果显示,hutB位于外周质中,存在信号肽切割位点,没有跨膜结构域,氨基酸序列含有1个cA MP和cG MP的蛋白激酶磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点等多个活性位点。系统进化树结果显示,溶藻弧菌hutB与坎氏弧菌(Vibrio campbellii)和哈氏弧菌(Vibrio harveyi)聚为一簇。qR T-PCR技术初步探究hutB在不同铁源下的表达量,结果表明,溶藻弧菌hutB在含有FeC l3的富铁培养基中,表达量与对照组相比差异不显著;在含有血红素的条件下表达量上调;在同时含有2-2'二联吡啶和血红素时上调极显著(P<0.01);在含2-2'二联吡啶的铁限制环境下,表达量下调极显著(P<0.01)。

关键词：溶藻弧菌 hutB基因血红素摄取

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溶藻弧菌转运蛋白TolB的免疫原性与免疫保护性

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生物技术通报 2015年第7期31卷 143-149页

作者：庞欢瑛周泽军张燕飞李静邱明生丁燏简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

旨在研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901转运蛋白Tol B作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的全基因组序列,设计特异性引物PCR扩增tol B的基因全长序列。序列分析显示,该基因(Gen Bank登录号JQ846501)全长1 353 bp,共编码450个... 详细信息

旨在研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901转运蛋白Tol B作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的全基因组序列,设计特异性引物PCR扩增tol B的基因全长序列。序列分析显示,该基因(Gen Bank登录号JQ846501)全长1 353 bp,共编码450个氨基酸残基。BLAST分析发现,溶藻弧菌tol B基因与其他已知弧菌的tol B具有较高的同源性,序列保守,可作为共同抗原候选蛋白。用原核表达的tol B蛋白免疫SPF级小鼠,制备多克隆抗体,ELISA效价达1∶40 000。免疫印迹表明鼠抗tol B血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应。为进一步研究tol B对石斑鱼(Epinephelus awoara)的免疫保护性,用Tol B蛋白两次免疫石斑鱼,ELISA检测发现,免疫石斑鱼血清的抗体效价在第4周达到峰值(1∶2 048)。攻毒实验结果表明Tol B对石斑鱼的免疫保护率为76%。结果表明,溶藻弧菌转运蛋白Tol B具有较好的免疫原性和免疫保护性,可作为弧菌亚单位疫苗的候选抗原。

关键词：溶藻弧菌 tol B基因免疫原性免疫保护

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哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达

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生物技术通报 2015年第6期31卷 183-188页

作者：朱帆丁燏鲁义善简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶(GR)基因,并构建其原核表达载体,以获得相应的表达蛋白。将GR和p ET-32a(+)通过Bam H I和Xho I双酶切后,体外用T4连接酶连接,构建重组质粒p ET-GR;然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半... 详细信息

经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶(GR)基因,并构建其原核表达载体,以获得相应的表达蛋白。将GR和p ET-32a(+)通过Bam H I和Xho I双酶切后,体外用T4连接酶连接,构建重组质粒p ET-GR;然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用SDS-PAGE分析表达情况和表达条件。SDS-PAGE电泳获得分子量约为68.9 k D融合蛋白条带。在*** BL21(DE3)中重组质粒p ET-GR的表达条件为28℃,0.7 mmol/L的IPTG浓度诱导4 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达。哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因在大肠杆菌中获得了高效表达。

关键词：哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆原核表达

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卵形鲳鲹耐低温候选基因△6FAD全长cDNA序列的克隆与表达分析

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生物技术通报 2015年第7期31卷 115-123页

作者：韩洪波王忠良陈刚汤保贵张健东黄建盛周晖施纲潘传豪广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088

采用c DNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆了卵形鲳鲹△6脂肪酸去饱和酶(△6FAD)的c DNA全长序列,并对其基因和蛋白序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析... 详细信息

采用c DNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆了卵形鲳鲹△6脂肪酸去饱和酶(△6FAD)的c DNA全长序列,并对其基因和蛋白序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析了该基因在不同温度条件下的表达差异及低温下的时序表达模式。结果显示,卵形鲳鲹△6FAD基因c DNA序列全长1 908 bp,其中开放阅读框为1 329 bp,3'非编码区431 bp,5'非编码区135 bp,共编码442个氨基酸;其编码蛋白属于疏水性蛋白,无信号肽特征,含有大量蛋白质二级结构和该家族典型的组氨酸富集区及细胞色素b5结构域。系统进化分析表明,卵形鲳鲹△6FAD基因与尖吻鲈、军曹鱼的△6FAD基因在进化关系上最为接近,其次是大菱鲆、蓝鳍金枪鱼和点带石斑鱼,但与斑马鱼、小鼠和人△6FAD基因进化关系较远。实时荧光定量PCR结果表明,该基因的表达与环境温度和胁迫时间存在明显相关性,其表达水平在降温过程中随温度降低而先缓慢下降后又迅速升高,在不同的低温环境下表现出不同的时序表达模式:13℃时,随时间延长该基因的表达量呈现先降低后又升高至原来水平的变化趋势,16℃和19℃时则表现出一种随时间延长逐渐降低的反馈式调节方式。

关键词：卵形鲳鲹 △6脂肪酸去饱和酶 cDNA克隆低温胁迫

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斜带石斑鱼IL-10基因的克隆及其原核表达

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生物技术通报 2015年第9期31卷 131-137页

作者：肖周婷黄郁葱简纪常鲁义善吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

白介素10(Interleukin-10,IL-10)是一个重要的多效细胞因子,主要作用是介导炎症反应和调控一些免疫细胞的分化和增殖。利用同源克隆和RACE-PCR技术获得全长为1 104 bp的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IL-10基因。该基因ORF为564 bp,... 详细信息

白介素10(Interleukin-10,IL-10)是一个重要的多效细胞因子,主要作用是介导炎症反应和调控一些免疫细胞的分化和增殖。利用同源克隆和RACE-PCR技术获得全长为1 104 bp的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IL-10基因。该基因ORF为564 bp,编码187个氨基酸,预测蛋白分子量为21.7 k D,等电点为5.74。氨基酸同源性比对及进化分析结果显示,斜带石斑鱼IL-10氨基酸序列和吉富罗非鱼(***)同源性最高,达72.25%。利用双酶切及质粒重组技术构建IL-10原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导原核表达。SDS-PAGE分析显示,融合蛋白分子量为37.5 k D,与预期相符;在IPTG为0.02mmol/L,37℃诱导3 h,蛋白包涵体的表达量最大。

关键词：斜带石斑鱼(Epinephelus coioides) Interleukin-10 基因克隆重组表达

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