检索结果-内蒙古大学图书馆

红罗非鱼Na^+-K^+-ATPase α基因的克隆及其在不同盐度条件下mRNA表达差异

生物技术通报 2014年第3期30卷 137-145页

作者：王忠良张健东黄建盛汤保贵周晖施钢潘传豪吴灶和陈刚广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

为获知红罗非鱼(Oreochromis sp.)Na+-K+-ATPaseα基因的全长分子结构及其在不同盐度条件下的表达情况,采用同源克隆及cDNA末端快速扩增(RACE-PCR)方法,首次在红罗非鱼鳃组织中克隆到了全长为3 379 bp的Na+-K+-ATPaseα基因全长cDNA序列... 详细信息

为获知红罗非鱼(Oreochromis sp.)Na+-K+-ATPaseα基因的全长分子结构及其在不同盐度条件下的表达情况,采用同源克隆及cDNA末端快速扩增(RACE-PCR)方法,首次在红罗非鱼鳃组织中克隆到了全长为3 379 bp的Na+-K+-ATPaseα基因全长cDNA序列,该序列包含3 072 bp的开放阅读框(ORF),143 bp的5'末端非编码区(UTR)和164 bp的3'末端非编码区(UTR),编码1023个氨基酸,预测分子量为112.5 kD,理论等电点为5.26。BLAST分析显示红罗非鱼Na+-K+-ATPaseα基因编码的氨基酸序列与其它已知物种相应基因编码的氨基酸序列的同源性达到97%-99%;系统进化分析显示,红罗非鱼Na+-K+-ATPaseα亚基与萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)和莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)亲缘关系较近。应用Real-time PCR技术,以β-actin基因为内参,对不同盐度(0、15、25、32 g/L)条件下鳃组织中Na+-K+-ATPaseα基因的表达情况进行了比较分析,结果表明,当盐度为25 g/L时,Na+-K+-ATPaseα基因的表达量达到峰值,而盐度升至32 g/L时,其表达量呈下降趋势;各盐度处理组中,养殖12 h后Na+-K+-ATPaseα基因的mRNA表达量显著上升(P<0.05)并达到最高;随着养殖时间的延长,24 h后该基因mRNA表达量开始降低,但仍然显著高于对照组的表达量值(P<0.05)。

关键词：红罗非鱼 Na+-K+-ATPase α 基因 cDNA 末端快速扩增实时荧光定量 PCR

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鱼类致病杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)特异性PCR检测方法的建立

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广东海洋大学学报 2014年第4期34卷 56-61页

作者：夏洪丽鲁义善汤菊芬蔡佳汪美夏立群广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088

鱼类诺卡氏菌病是全球性的鱼病,杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)是引起鱼类诺卡氏菌病的主要病原之一。根据杀鲑诺卡氏菌16S-23S转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立特异性PCR检测杀鲑诺卡氏菌的方法。结果表明,筛选的PCR引物可特异... 详细信息

鱼类诺卡氏菌病是全球性的鱼病,杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)是引起鱼类诺卡氏菌病的主要病原之一。根据杀鲑诺卡氏菌16S-23S转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立特异性PCR检测杀鲑诺卡氏菌的方法。结果表明,筛选的PCR引物可特异性地扩增出杀鲑诺卡氏菌的ITS片段,检测灵敏度(DNA浓度)为28.3 pg·μL-1。检测人工感染杀鲑诺卡氏菌的鱼组织,结果显示,该方法可从未分离到病原菌的病鱼组织中检出阳性片段,较传统细菌分离鉴定方法更为高效灵敏。

关键词：杀鲑诺卡氏菌转录间隔区聚合酶链式反应检测

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溶藻弧菌双组分调控系统PhoR/PhoB的基因克隆及生物信息学分析

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广东海洋大学学报 2014年第6期34卷 22-30页

作者：张燕飞庞欢瑛吴灶和简纪常鲁义善广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

双组分调控系统(Two-component Regulatory System)在致病菌的生长及毒力调控中起重要作用。克隆溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901株组氨酸激酶PhoR和反应调控因子PhoB的全长基因,并对其进行生物信息学分析。序列分析结果显示,pho ... 详细信息

双组分调控系统(Two-component Regulatory System)在致病菌的生长及毒力调控中起重要作用。克隆溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901株组氨酸激酶PhoR和反应调控因子PhoB的全长基因,并对其进行生物信息学分析。序列分析结果显示,pho R(Gen Bank登录号:KJ958404)全长1 299 bp,共编码432个氨基酸;pho B(Gen Bank登录号:KJ863646)全长690 bp,编码229个氨基酸。构建PhoR/PhoB的系统进化树,结果显示,溶藻弧菌PhoR/PhoB与副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)有较近亲缘关系。利用SWISS-MODEL软件,对PhoR/PhoB中两个相对保守的功能域HATPase_c和REC进行同源建模,发现HATPase_c具有1个ATP结合位点,REC具有4个天冬氨酸活性位点。

关键词：溶藻弧菌双组分调控系统 PhoR/PhoB 基因克隆生物信息学

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溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化

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广东海洋大学学报 2014年第3期34卷 52-57页

作者：陈立明庞欢瑛简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东海洋大学广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温... 详细信息

根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温度、诱导时间、诱导IPTG浓度等条件的优化,最后探究其纯化时最佳咪唑洗脱浓度。结果表明:DTD蛋白成功表达,且其以包涵体的形式存在,在诱导温度37℃、IPTG浓度0.1 mmol/L条件下诱导5 h表达量最高,纯化最佳咪唑洗脱浓度为150 mmol/L。

关键词：溶藻弧菌 dtd 基因克隆原核表达条件优化

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溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统注射装置蛋白VscO的原核表达及免疫原性

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广东海洋大学学报 2014年第3期34卷 41-46页

作者：庞欢瑛周泽军丁燏黄郁葱吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院广东海洋大学广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白VscO作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌VscO序列(***179947),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscO基因,序列分析结果显示,该基因全长462 bp,理论分子质量为18.430ku。将vscO基因定向插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-vscO。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为22 ku的VscO融合蛋白,且该蛋白主要以包涵体形式存在。VscO蛋白表达和纯化的最优条件为:0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4 h,咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,获得高效多克隆抗体。Western-blotting结果表明,鼠抗VscO血清既能与重组VscO蛋白发生反应,也能与分离自溶藻弧菌约22 ku的天然蛋白发生反应,提示T3SS注射装置蛋白VscO可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。

关键词：溶藻弧菌 vscO基因 Ⅲ型分泌系统原核表达免疫原性

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大黄和公丁香对致病性哈氏弧菌及其生物膜的体外抑制作用

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安徽农业科学 2014年第24期42卷 8188-8190,8202页

作者：黎家勤庞欢瑛简纪常汤菊芬广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088

[目的]观察大黄(Rheum officinale)和公丁香(Flos caryophylli)对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)及其生物膜(Biofilm)的体外抑制作用。[方法]采用琼脂扩散法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌的体外抑菌作用;采用倍比稀释法测定大黄和公丁香对哈氏... 详细信息

[目的]观察大黄(Rheum officinale)和公丁香(Flos caryophylli)对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)及其生物膜(Biofilm)的体外抑制作用。[方法]采用琼脂扩散法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌的体外抑菌作用;采用倍比稀释法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);采用MTT法评价2种中草药液对哈氏弧菌生物膜形成的影响。[结果]大黄对哈氏弧菌的抑菌圈直径为(15.31±0.4)mm,MIC和MBC均为7.813 mg/ml;公丁香对哈氏弧菌的抑菌圈直径为(11.53±0.6)mm,MIC和MBC分别为15.625和62.5 mg/ml;2种中草药液浓度分别在7.81和0.97 mg/ml以上时对生物膜的形成有极显著抑制作用(P<0.01)。[结论]大黄和公丁香对哈氏弧菌及其生物膜均有明显抑制作用,其中大黄的作用比公丁香更强。

关键词：大黄公丁香哈氏弧菌生物膜体外抑制作用

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溶藻弧菌二氢硫辛酰胺脱氢酶基因克隆及其生物信息学分析

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广东海洋大学学报 2014年第1期34卷 1-8页

作者：庞欢瑛陈立明蔡佳汤菊芬王蓓吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

根据溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)二氢硫辛酰胺脱氢酶(dihydrolipoamide dehydrogenase,DLD)的基因序列设计1对特异性引物。PCR扩增结果显示,DLD(GenBank登录号AGK62253)全长1 428 bp,共编码475个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测其分子质量约为50.998 ku,等电点为5.51。细胞定位、SignalP 4.0、TMHMM Server 2.0和SoftBerry-Psite预测结果显示,DLD位于细胞质中,在第29至30个氨基酸之间存在信号肽,不存在跨膜区,氨基酸序列含有1个Asn-糖基化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、6个酪蛋白激酶II磷酸化位点等多个活性位点。系统进化树结果显示,溶藻弧菌DLD与副溶血弧菌(***)聚为一簇。用Kyte-Doolittle亲水性参数、Karplus-Schulz柔韧性参数、Emini表面可及性参数和Jameson-Wolf抗原性参数分别预测,DLD可能的B细胞抗原优势表位分别是第5~10、106~110、120~125、158~163和175~180区段。利用SWISS-MODEL软件,模拟DLD亚基三维结构模型,结果显示其与大肠杆菌(Escherichia coli)DLD蛋白有相似构型。Kegg分析发现,其涉及糖酵解和糖异生等9条信号通路。从生物信息学角度验证了DLD作为弧菌共同抗原的可行性。

关键词：溶藻弧菌基因克隆二氢硫辛酰胺脱氢酶生物信息学分析

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哈维氏弧菌GST核酸疫苗制备及其对斜带石斑鱼的免疫保护作用

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广东海洋大学学报 2014年第4期34卷 50-55页

作者：王海阳黄郁葱丁燏朱帆简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省高等学校水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524025 仲恺农业工程学院广东广州510225

通过同源引物从致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ZJ0603基因组中克隆GST的开放阅读框(ORF),构建真核表达质粒pcDNA-GST。大量抽提重组质粒后,于背鳍基部肌肉注射重组质粒免疫斜带石斑鱼(Epinephelus coioides),分析重组质粒的免疫效果... 详细信息

通过同源引物从致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ZJ0603基因组中克隆GST的开放阅读框(ORF),构建真核表达质粒pcDNA-GST。大量抽提重组质粒后,于背鳍基部肌肉注射重组质粒免疫斜带石斑鱼(Epinephelus coioides),分析重组质粒的免疫效果。通过核酸水平检测重组质粒在鱼体肝、肌肉、头肾和脾脏组织的分布;用ELISA法检测鱼体血清的抗体水平,用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。结果表明:该序列全长615 bp;免疫7 d后,鱼体中均有质粒分布;斜带石斑鱼血清中产生抗GST的高效抗体(1∶4 096);相应的目的蛋白也在鱼体中成功表达。攻毒后,疫苗免疫保护率达80%,表明GST可作为防治哈维氏弧菌病有效候选抗原。

关键词：哈维氏弧菌谷胱甘肽硫转移酶斜带石斑鱼核酸疫苗

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溶藻弧菌acfA基因克隆与生物信息学分析

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广东海洋大学学报 2014年第1期34卷 9-14页

作者：程海燕庞欢瑛鲁义善简纪常吴灶和蔡双虎广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省普通高等学校水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

溶藻弧菌引起海水养殖产业弧菌病的主要病原,附着定植因子基因acfA是溶藻弧菌重要毒力基因之一,其表达产物是溶藻弧菌有效定植在宿主肠道上所必需的蛋白。根据弧菌属细菌acfA基因基因保守区设计引物,采用Touchdown PCR扩增acfA基因部分... 详细信息

溶藻弧菌引起海水养殖产业弧菌病的主要病原,附着定植因子基因acfA是溶藻弧菌重要毒力基因之一,其表达产物是溶藻弧菌有效定植在宿主肠道上所必需的蛋白。根据弧菌属细菌acfA基因基因保守区设计引物,采用Touchdown PCR扩增acfA基因部分序列,Inverse PCR和Nested PCR扩增已知序列侧翼序列,成功克隆了溶藻弧菌acfA基因全长。克隆的acfA基因序列全长为743 bp,开放阅读框长度为648 bp组成,共编码215个氨基酸,在5′端上游未发现-35区和-10区序列。演绎的ACFA蛋白N端有18个氨基酸信号肽序列,表明该蛋白是分泌型蛋白;蛋白结构分析表明主要由α螺旋和不规则卷曲构成。BLAST分析表明,该蛋白氨基酸序列与其他弧菌相应蛋白同源性较高,是较保守的外膜蛋白。

关键词：溶藻弧菌,acfA基因克隆蛋白结构

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溶藻弧菌HY9901血红素结合蛋白HutB的原核表达及纯化

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广东海洋大学学报 2014年第3期34卷 47-51页

作者：薛丽丽庞欢瑛黄郁葱吴灶和简纪常周泽军广东海洋大学水产学院广东海洋大学广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901血红素结合蛋白HutB作为疫苗候选抗原的可能性,采用PCR方法扩增*** HY9901 hutB基因全长序列,克隆到pMD18-T载体,经双酶切、连接后,定向插入到pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET-HutB,转入... 详细信息

为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901血红素结合蛋白HutB作为疫苗候选抗原的可能性,采用PCR方法扩增*** HY9901 hutB基因全长序列,克隆到pMD18-T载体,经双酶切、连接后,定向插入到pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET-HutB,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE验证后,优化诱导表达条件和纯化条件,并进行Western-blot分析。结果表明,HutB蛋白在***中诱导表达的最优条件:0.4 mmol/L IPTG,37℃诱导4h,表达的蛋白分子量与预期大小相符,主要以包涵体的形式存在,300 mmol/L咪唑洗脱时效果最佳,能与鼠抗His-tag单抗特异性结合。

关键词：溶藻弧 hutB基因原核表达优化纯化

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