检索结果-内蒙古大学图书馆

生物技术通报 2013年第12期29卷 113-118页

作者：黄瑜张雪利蔡佳简纪常吴灶和鲁义善樊云霞广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

为研究红笛鲷(Lutjanus sanguineus)T淋巴细胞酪氨酸激酶(Lymphocyte cell kinase,LCK)蛋白在机体中的组织分布情况,克隆出红笛鲷lck(LS-lck)基因序列,经酶切、连接等步骤,构建重组质粒pET-28a-LS-LCK,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株... 详细信息

为研究红笛鲷(Lutjanus sanguineus)T淋巴细胞酪氨酸激酶(Lymphocyte cell kinase,LCK)蛋白在机体中的组织分布情况,克隆出红笛鲷lck(LS-lck)基因序列,经酶切、连接等步骤,构建重组质粒pET-28a-LS-LCK,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株后进行IPTG诱导表达。通过表达条件的优化,重组蛋白在37℃、0.03 mmol/L IPTG条件下诱导4 h后获得最大表达量,且主要以包涵体形式存在。Western blot检测重组蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,表明为目的蛋白。利用纯化后的rLS-LCK重组蛋白免疫小鼠,获得了1∶40 000高效价的抗血清,Western blot分析显示,融合蛋白能被小鼠的阳性血清识别,说明rLS-LCK融合蛋白具有较好的免疫反应性和免疫原性。

关键词：红笛鲷 lck基因原核表达 Western blot分析抗原性分析

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溶藻弧菌HY9901外膜蛋白OmpH的基因克隆及其生物信息学分析

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生物技术通报 2013年第4期29卷 116-122页

作者：周泽军庞欢瑛丁燏简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

根据已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列设计1对特异性引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株外膜蛋白OmpH的全长基因。结果显示,该基因(GenBank登录号:JX855924)全长573 bp,共编码190个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测... 详细信息

根据已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列设计1对特异性引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株外膜蛋白OmpH的全长基因。结果显示,该基因(GenBank登录号:JX855924)全长573 bp,共编码190个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测其分子量约为21.1 kD,等电点为9.02。SignalP 4.0、TMHMM Server 2.0和SofiBerry-Psite预测结果显示,OmpH不存在信号肽与跨膜区,含有1个N-糖基化位点,6个磷酸化位点,1个内质网靶信号位点以及3个微体C末端靶信号位点。利用MAGE5.0软件,以邻位相连法构建OmpH系统进化树,结果显示,溶藻弧菌OmpH与副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)等有较近亲缘关系。采用多种参数成功预测了OmpH可能的B细胞抗原优势表位,分别是第5-10、106-110、120-125、158-163和175-180区段。利用SWISS-MODEL软件,模拟了OmpH亚基三维结构模型,且与其同源蛋白大肠杆菌(Escherichia coli)Skp蛋白有相似构型。

关键词：溶藻弧菌基因克隆 OmpH基因外膜蛋白生物信息学分析

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利用酵母双杂交系统筛选草鱼呼肠孤病毒NS38相互作用蛋白

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海洋与湖沼 2013年第2期44卷 305-309页

作者：李杰闫秀英丁燏吴灶和简纪常谢吉国广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东海洋大学水产学院湛江524025 仲恺农业工程学院广州510225

采用酵母双杂交技术,对草鱼呼肠孤病毒096(GCRV096)非结构蛋白NS38相互作用的蛋白进行了筛选,并对阳性克隆中的插入序列进行测序与生物信息学分析。结果表明,含有重组质粒pGBKT7-NS38的酵母菌Y2HGold与含有草鱼肾脏细胞(CIK)cDNA文库质... 详细信息

采用酵母双杂交技术,对草鱼呼肠孤病毒096(GCRV096)非结构蛋白NS38相互作用的蛋白进行了筛选,并对阳性克隆中的插入序列进行测序与生物信息学分析。结果表明,含有重组质粒pGBKT7-NS38的酵母菌Y2HGold与含有草鱼肾脏细胞(CIK)cDNA文库质粒的酵母菌Y187融合成功,并筛选得到3株阳性克隆;发现两条不同的插入序列,其中一条序列编码的蛋白与40S核糖体蛋白S16亚基的同源性高达99%,而另一序列相应的蛋白不存在匹配的蛋白。该结果为进一步深入研究NS38蛋白在GCRV096复制过程中的生物学功能奠定了基础。

关键词： GCRV096 NS38 蛋白质相互作用酵母双杂交

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罗非鱼无乳链球菌DNA疫苗的构建及免疫效果研究

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中国海洋大学学报（自然科学版） 2013年第12期43卷 30-35页

作者：王蓓简纪常蔡双虎黄郁葱汤菊芬吴灶和中国海洋大学水产学院山东青岛266003 广东海洋大学水产学院广东湛江524025 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524025 仲恺农业工程学院广东广州510225

为研究罗非鱼源无乳链球菌重组DNA疫苗对鱼体的免疫保护作用,将Sip基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA-Sip,并以肌肉注射方式免疫吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)。免疫后第7、28天取样,采用PCR及RT-PCR方法检测pcD... 详细信息

为研究罗非鱼源无乳链球菌重组DNA疫苗对鱼体的免疫保护作用,将Sip基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA-Sip,并以肌肉注射方式免疫吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)。免疫后第7、28天取样,采用PCR及RT-PCR方法检测pcDNA-Sip在各个组织(包括肌肉、脾脏、头肾、鳃及肝脏)中的表达情况;分别于免疫后第7、14、21、28天采集血清,使用ELISA方法检测抗体效价;免疫28d后进行攻毒实验,计算疫苗的免疫保护率。结果表明,重组质粒pcDNA-Sip可以在上述各组织中被检测到;免疫21d后抗体效价出现峰值达1∶5 120;免疫保护率为90%。由此证实,pcDNA-Sip重组质粒可以转染到罗非鱼组织细胞,并可在鱼体中持续表达,同时有较高的免疫保护率。

关键词：无乳链球菌免疫罗非鱼重组DNA疫苗

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红笛鲷tdt基因融合蛋白原核表达条件的优化及纯化

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广东海洋大学学报 2013年第1期33卷 44-49页

作者：黄瑜张雪利鲁义善简纪常吴灶和黄浦江周泽军广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省高等学校水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524025 仲恺农业工程学院广东广州510225

克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)末端脱氧核糖核酸转移酶TdT蛋白(Terminal deoxynucleotidyl transferases)成熟肽基因序列,并与pET-32a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-32a-TdT,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。运用传统方法优化诱导条件,以提高重组融合蛋白的表达效率。SDS-PAGE分析表明,37℃、0.7 mmol/L IPTG条件下诱导4 h后,TdT融合蛋白的表达量最大,分子质量大小与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式存在。利用HisTrap HP亲和层析柱使TdT蛋白得到进一步纯化,最佳咪唑洗脱浓度为300 mmol/L,Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性的结合,表明表达蛋白为目的蛋白。

关键词：红笛鲷 tdt基因原核表达优化纯化 Western blot分析

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融合蛋白IL6-OmpW的质粒构建及表达纯化

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广东海洋大学学报 2013年第4期33卷 43-48页

作者：黄浦江黄郁葱简纪常吴灶和鲁义善黄瑜樊云霞广东海洋大学水产学院广东湛江524025 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524025 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524025 仲恺农业工程学院广东广州510225

以重组质粒pMD18-T/IL6和pMD18-T/OmpW为模板,分别扩增红笛鲷IL-6基因和哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因,运用PCR重叠延伸剪切技术,将IL-6和OmpW基因融合,将融合基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经异丙基... 详细信息

以重组质粒pMD18-T/IL6和pMD18-T/OmpW为模板,分别扩增红笛鲷IL-6基因和哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因,运用PCR重叠延伸剪切技术,将IL-6和OmpW基因融合,将融合基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白高效表达,融合蛋白分子质量约为66.6 ku。优化后表达条件为温度37℃,IPTG浓度0.2 mmol·L-1,诱导时间5 h。用HisTrap HP亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol·L-1,纯化蛋白的质量浓度为480μg·mL-1。Western-blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异反应,表明目的蛋白得以正确表达。

关键词：哈维氏弧菌OmpW 红笛鲷IL-6 基因融合原核表达

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草鱼白细胞介素6基因克隆与表达分析

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广东海洋大学学报 2013年第3期33卷 46-51页

作者：颜鹏简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江524025 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524025 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524025 仲恺农业工程学院广东广州510225

白细胞介素6(IL-6)是一个多效的细胞因子,在机体免疫应答、急性期反应以及造血调控等过程中发挥着重要作用。以草鱼(Ctenopharyngodon idella)为研究对象,采用RT-PCR和Smart RACE技术克隆获得草鱼IL-6(CiIL-6)cDNA序列,CiIL-6的cDNA全长... 详细信息

白细胞介素6(IL-6)是一个多效的细胞因子,在机体免疫应答、急性期反应以及造血调控等过程中发挥着重要作用。以草鱼(Ctenopharyngodon idella)为研究对象,采用RT-PCR和Smart RACE技术克隆获得草鱼IL-6(CiIL-6)cDNA序列,CiIL-6的cDNA全长为1 145 bp,包含一个长为702 bp的开放阅读框,能编码233个氨基酸,预测CiIL-6的蛋白质分子质量为26.74 ku,等电点为8.72。其中5'和3'非编码区(UTR)分别为86 bp和357bp。氨基酸同源性分析显示,草鱼和斑马鱼(Danio rerio)的亲缘关系最近,它们的CiIL-6氨基酸同源性高达76%,而与其他物种的同源性均低于30%。RT-PCR的结果显示,CiIL-6在健康草鱼的胸腺、头肾和脾脏表达最高,而在鳃、胃和心脏中的表达量最低。

关键词：草鱼白细胞介素6 基因克隆基因表达 RACE

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溶藻弧菌免疫胶体金快速检测试纸条的制备

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广东海洋大学学报 2013年第4期33卷 49-55页

作者：王蓓梁军简纪常鲁义善蔡双虎黄郁葱汤菊芬蔡佳吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江524025 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524025 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524025 仲恺农业工程学院广东广州510225

采用溶藻弧菌ATCC17749菌体作为抗原免疫新西兰大白兔,制备兔抗溶藻弧菌多克隆抗体;利用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金及胶体金-抗体结合物,并将其喷涂在玻璃纤维膜上冷冻干燥;在硝酸纤维素膜上包被兔抗溶藻弧菌多克隆抗体和羊抗兔Ig... 详细信息

采用溶藻弧菌ATCC17749菌体作为抗原免疫新西兰大白兔,制备兔抗溶藻弧菌多克隆抗体;利用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金及胶体金-抗体结合物,并将其喷涂在玻璃纤维膜上冷冻干燥;在硝酸纤维素膜上包被兔抗溶藻弧菌多克隆抗体和羊抗兔IgG分别作为检测线和控制线;将处理后的玻璃纤维素膜、硝酸纤维膜、样品垫及吸水纸组装成双抗夹心试纸条,并对试纸条灵敏度、特异性、稳定性进行评价。结果表明,制备的兔抗溶藻弧菌多克隆抗体的效价可达1∶512 000;胶体金溶胶的最佳制备条件为:加入1.8 mL 10 mg/mL的柠檬酸三钠,500 W微波炉中火加热10 min;试纸条检测线和质控线的抗体最佳包被量分别为8.0 mg/mL和1.0 mg/mL;试纸条检测灵敏度为1×106cfu/mL,特异性试验显示,试纸条与哈氏弧菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、美人鱼弧菌、弗氏弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等8株菌无交叉反应;稳定性试验表明,试纸在4℃干燥条件下能稳定保存5个月以上。制备的溶藻弧菌多克隆检测试纸条可灵敏、较特异地检测源自病鱼的溶藻弧菌,整个检测过程可在10 min内完成,适用于溶藻弧菌的快速检测。

关键词：溶藻弧菌胶体金免疫层析试纸条

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溶藻弧茵毒力相关基因acfA口、toxR的功能研究

溶藻弧茵毒力相关基因acfA口、toxR的功能研究

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2013年中国水产学会鱼病专业委员会学术研讨会

作者：程海燕蔡双虎鲁义善简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

溶藻弧菌是海洋环境中常见的细菌类群之一,给渔业生产造成巨大损失,其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大,属条件致病菌。经国内外研究表明,其中acfA和toxR为毒力相关基因,本研究以溶藻弧菌HY9901为对象,利用PC... 详细信息

溶藻弧菌是海洋环境中常见的细菌类群之一,给渔业生产造成巨大损失,其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大,属条件致病菌。经国内外研究表明,其中acfA和toxR为毒力相关基因,本研究以溶藻弧菌HY9901为对象,利用PCR技术克隆毒力基因acfA和toxR,并利用插入突变技术分别构建acfA和toxR插入失活突变株,并利用同源重组技术构建其互补株,研究其各种致病相关的表型变化,同时运用蛋白质组学研究突变株的蛋白表达变化。

关键词：溶藻弧菌 acfA toxR 插入突变蛋白质组学

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藻弧菌毒力相关基因acfA、toxR的功能研究

藻弧菌毒力相关基因acfA、toxR的功能研究

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2013年环北部湾高校研究生海洋论坛

作者：程海燕蔡双虎鲁义善简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院湛江 524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江 524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江 524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江 524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江 524088 仲恺农业工程学院广东广州 510225

溶藻弧菌是海洋环境中常见的细菌类群之一,给渔业生产造成巨大损失,其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大,属条件致病茵。经国内外研究表明,其中acfA和toxR为毒力相关基因,本研究以溶藻弧菌HY9901为对象,利用PC... 详细信息

溶藻弧菌是海洋环境中常见的细菌类群之一,给渔业生产造成巨大损失,其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大,属条件致病茵。经国内外研究表明,其中acfA和toxR为毒力相关基因,本研究以溶藻弧菌HY9901为对象,利用PCR技术克隆毒力基因acfA和toxR,并利用插入突变技术分别构建acfA和toxR插入失活突变株,并利用同源重组技术构建其互补株,研究其各种致病相关的表型变化,同时运用蛋白质组学研究突变株的蛋白表达变化。结果表明a班基因的缺失,使其生长略有下降,生物被膜形成能力显著提高,对胞外蛋白酶的表达有抑制作用。而toxR基因的缺失,没有明显影响其成长及生物膜的形成,但对胞外蛋白酶的表达也有抑制作用。两种基因的缺失对其蛋白的表达存在不同的变化。从而确定这两种毒力基因对溶藻弧菌毒力的影响。研究结果为开发鱼用减毒溶藻弧菌活疫苗,防治弧菌病的暴发有重要作用。

关键词：溶藻弧茵 acfA toxR 插入突变蛋白质组学

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