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2013年中国水产学会鱼病专业委员会学术研讨会

作者：王海洋丁熵鲁义善简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

本研究通过同源引物从实验室保存的哈维氏弧菌基因组扩增得到了GPx和GST基因,将两个基因分别克隆至pMD-18T载体测序,并进行生物信息学分析.GPx 基因全长546bp,含有完整的ORF,编码182个氨基酸组成的蛋白质.氨基酸序列经过Blast对比,与霍...

本研究通过同源引物从实验室保存的哈维氏弧菌基因组扩增得到了GPx和GST基因,将两个基因分别克隆至pMD-18T载体测序,并进行生物信息学分析.GPx 基因全长546bp,含有完整的ORF,编码182个氨基酸组成的蛋白质.氨基酸序列经过Blast对比,与霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的序列相似性高达97-99％.GST基因全长618bp,含有完整的ORF,编码206个氨基酸组成的蛋白质.氨基酸序列经过Blast对比,与霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的序列相似性为96-98％.

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红笛鲷CD40和去除信号肽CD40的原核表达

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广东海洋大学学报 2013年第4期33卷 31-37页

作者：樊云霞简纪常鲁义善吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

根据红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD40基因cDNA全长序列设计2对特异性引物,利用RT-PCR技术从红笛鲷头肾组织中扩增出CD40 ORF序列和去信号肽序列,分别与原核表达载体pET-32a(+)相连,构建原核重组表达质粒,命名为pET32-CD40和pET32-△CD... 详细信息

根据红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD40基因cDNA全长序列设计2对特异性引物,利用RT-PCR技术从红笛鲷头肾组织中扩增出CD40 ORF序列和去信号肽序列,分别与原核表达载体pET-32a(+)相连,构建原核重组表达质粒,命名为pET32-CD40和pET32-△CD40,并分别转化至大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,分别于54 ku和53 ku处有清晰的目的蛋白条带。融合蛋白的表达效率最佳的表达条件,pET32-CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.4,IPTG浓度为0.08 mmol/L,诱导5 h;pET32-△CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.6,IPTG浓度为0.10 mmol/L,诱导6 h。在各自优化的表达条件下,pET32-△CD40融合蛋白表达量较pET32-CD40融合蛋白高。RNAstructure软件分析发现,CD40的mRNA 5′端序列形成复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,表明信号肽序列的存在可能对CD40基因在原核细胞中的表达有一定的影响。

关键词：红笛鲷 CD40基因原核表达

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鰤鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化

鰤鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化

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热带海洋科学学术研讨会暨第八届广东海洋湖沼学会、第七届广东海洋学会会员代表大会

作者：夏立群王蓓夏洪丽黄郁葱简纪常鲁义善广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省高等学校水产经济动物病害控制重点实验室

对鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea）ZJ0503的增菌培养基和生长条件进行优化。研究了温度、盐度、初始pH值对鰤鱼诺卡氏菌生长的影响,并通过单因素试验对培养基的碳源、氮源和无机盐成分进行了筛选,采用正交实验法对培养基各主要成分... 详细信息

对鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea）ZJ0503的增菌培养基和生长条件进行优化。研究了温度、盐度、初始pH值对鰤鱼诺卡氏菌生长的影响,并通过单因素试验对培养基的碳源、氮源和无机盐成分进行了筛选,采用正交实验法对培养基各主要成分的添加量进行了优化。结果表明鰤鱼诺卡氏菌最适宜生长条件为:温度为25℃、盐度为0.5%、pH6.5±0.2;经筛选,鰤鱼诺卡氏菌培养基中最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是酵母粉,促生长作用最强的两种无机盐是KHPO和CaCl;确立了培养基优化配方为:葡萄糖20g/L,酵母粉159/L,KHPO0.75g/L,CaCl 0.2g/L（单独灭菌）,NaCl 5g/L,pH 6.5±0.2。该研究对鰤鱼诺卡氏菌疫苗的大规模制备具有参考价值。

关键词：鰤鱼诺卡氏菌培养基培养条件优化

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草鱼NEDD4结合蛋白基因1原核表达条件的优化及纯化

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广东海洋大学学报 2013年第4期33卷 38-42页

作者：杨林蔡佳简纪常颜鹏鲁义善吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省高等学校水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524025 仲恺农业工程学院广东广州510225

通过PCR方法克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)NEDD4结合蛋白基因1(简称CiN4BP1)的开放阅读框(ORF)序列,将扩增产物与pET-32a(+)表达载体相连接,构建原核表达载体pET-N4BP1,对重组质粒进行酶切和测序鉴定,然后将其导入大肠杆菌BL21(DE... 详细信息

通过PCR方法克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)NEDD4结合蛋白基因1(简称CiN4BP1)的开放阅读框(ORF)序列,将扩增产物与pET-32a(+)表达载体相连接,构建原核表达载体pET-N4BP1,对重组质粒进行酶切和测序鉴定,然后将其导入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,检测该蛋白表达情况。SDS-PAGE分析表明,在温度为37℃,IPTG浓度为0.06 mmol/L,诱导时间为4 h时,N4BP1重组融合蛋白的表达量最高,蛋白分子质量为40.2 ku,与软件预测值大小相符,该蛋白主要以包涵体形式表达。利用His Trap HP亲和柱纯化目的蛋白;Western blot分析表明,N4BP1融合蛋白能与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应,说明该表达的蛋白为目的蛋白。

关键词：草鱼 N4BP1 原核表达表达条件优化纯化 Western blot分析

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溶藻弧菌毒力相关基因acfA、toxR的功能研究

溶藻弧菌毒力相关基因acfA、toxR的功能研究

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中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会

作者：程海燕蔡双虎鲁义善简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室仲恺农业工程学院

溶藻弧菌是海洋环境中常见的细菌类群之一,给渔业生产造成巨大损失,其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大,属条件致病菌。经国内外研究表明,其中acfA和toxR为毒力相关基因,本研究以溶藻弧菌HY9901为对象,利用PC... 详细信息

溶藻弧菌是海洋环境中常见的细菌类群之一,给渔业生产造成巨大损失,其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大,属条件致病菌。经国内外研究表明,其中acfA和toxR为毒力相关基因,本研究以溶藻弧菌HY9901为对象,利用PCR技术克隆毒力基因acfA和toxR,并利用插入突变技术分别构建acfA和toxR插入失活突变株,并利用同源重组技术构建其互补株,研究其各种致病相关的表型变化,同时运用蛋白质组学研究突变株的蛋白表达变化。结果表明acfA基因的缺失,使其生长略有下降,生物被膜形成能力显著提高,对胞外蛋白酶的表达有抑制作用。而toxR基因的缺失,没有明显影响其成长及生物膜的形成,但对胞外蛋白酶的表达也有抑制作用。两种基因的缺失对其蛋白的表达存在不同的变化。从而确定这两种毒力基因对溶藻弧菌毒力的影响。研究结果为开发鱼用减毒溶藻弧菌活疫苗,防治弧菌病的暴发有重要作用。

关键词：溶藻弧菌 acfA toxR 插入突变蛋白质组学

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GAPDH、SIP、GAPDH-SIP基因的真核构建及免疫作用

GAPDH、SIP、GAPDH-SIP基因的真核构建及免疫作用

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中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会

作者：李桂欢王蓓鲁义善汤菊芬黄郁葱吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室仲恺农业工程学院

利用PCR技术和重叠延伸(SOEing)PCR技术分别扩增罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQ0910株甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、表面免疫原性蛋白(SIP)、GAPDH-SIP基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建质粒pCDNA-GAPDH、pCDNA-SIP、pCDNA-SIP-GAPDH。以各重组质粒、pCDNA3.1(+)及生理盐水免疫吉富罗非鱼,受免鱼6周后进行人工攻毒试验。结果显示,上述3种DNA疫苗对罗非鱼均有较好的免疫原性,与对照组相比,免疫组血清中的抗体效价水平均显著性提高(p<0.05),pCDNA-GAPDH、pCDNA-SIP、pCDNA-SIP-GAPDH的免疫保护率分别为:55%、69%、74%。融合基因的保护率明显高于单个基因的,构建多价疫苗及其抗原组合将会是未来疫苗研制的主要方向。

关键词： GAPDH-SIP SIP 罗非鱼免疫作用

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无乳链球菌诱导吉富罗非鱼膜型免疫球蛋白D重链基因的克隆及组织表达

无乳链球菌诱导吉富罗非鱼膜型免疫球蛋白D重链基因的克隆及组织...

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中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会

作者：王培王蓓鲁义善蔡佳简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室仲恺农业工程学院

以灭活的无乳链球菌诱导后的吉富罗非鱼为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆出吉富罗非鱼mIgD全长并对其进行生物信息学分析。mIgD全长3347bp,开放阅读框包含3015bp,编码1004个氨基酸;预测分子量（MW）为... 详细信息

以灭活的无乳链球菌诱导后的吉富罗非鱼为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆出吉富罗非鱼mIgD全长并对其进行生物信息学分析。mIgD全长3347bp,开放阅读框包含3015bp,编码1004个氨基酸;预测分子量（MW）为110.9ku,理论等电点（PI）为6.24。mIgD基因由可变区和恒定区两部分组成,可变区具有典型的V-D-J结构,恒定区先后由μ1、CH1-CH2-CH3-CH4-CH5-CH6-CH7和跨膜区（TM）组成。重链恒定区CH1-CH7氨基酸序列同源性比对结果显示吉富罗非鱼IgD恒定区与庸鲽（64%）同源性最高,CH1H7相似性分别为53%、56%、45%、57%、63%、69%、69%,TM结构域相似性为54%;多序列比对结果显示罗非鱼mIgD的每个CH恒定区内均存在色氨酸和半胱氨酸的保守位点。利用RT-PCR技术对无乳链球菌诱导前后的吉富罗非鱼mIgD基因的组织分布状况进行分析,结果显示,在健康的罗非鱼体内,IgD基因主要在罗非鱼头肾、脾脏、胸腺中表达,而经灭活的无乳链球菌免疫48h后,mIgD mRNA的表达量在所有组织中都发生上调。将罗非鱼mIgD基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a（+）中,构建pET28-mIgD恒定区重组表达质粒,优化表达条件后,纯化融合蛋白,Western blot分析发现pET28-mIgD融合蛋白可与鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性结合,表明目的蛋白成功表达。

关键词：吉富罗非鱼 mIgD 基因克隆荧光定量PCR 原核表达

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哈维氏弧菌谷胱甘肽硫转移、过氧化物酶的克隆与免疫作用研究

哈维氏弧菌谷胱甘肽硫转移、过氧化物酶的克隆与免疫作用研究

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中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会

作者：王海洋丁燏鲁义善简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室仲恺农业工程学院

本研究通过同源引物从实验室保存的哈维氏弧菌基因组扩增得到了GPx和GST基因,将两个基因分别克隆至pMD-18T载体测序,并进行生物信息学分析。GPx基因全长546bp,含有完整的ORF,编码182个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸序列经过Blast对比,与... 详细信息

本研究通过同源引物从实验室保存的哈维氏弧菌基因组扩增得到了GPx和GST基因,将两个基因分别克隆至pMD-18T载体测序,并进行生物信息学分析。GPx基因全长546bp,含有完整的ORF,编码182个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸序列经过Blast对比,与霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的序列相似性高达97-99%。GST基因全长618bp,含有完整的ORF,编码206个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸序列经过Blast对比,与霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的序列相似性为96-98%。将两个基因分别亚克隆到原核表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-GPx和pET-GST,且在大肠杆菌BL21(DE3)中获得大量表达。其中GPx在37℃,4小时,IPTG浓度0.8mmol/L表达量达到最高;GST在37℃,5小时,IPTG浓度1.0 mmol/L表达量达到最高。通过镍亲和层析完成GPx、GST的分离纯化。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,纯化的蛋白为单一条带,分子量分别为17kDa和25kDa。将纯化的重组GPx、GST蛋白,通过腹腔注射的方式免疫斜带石斑鱼,4周后用致病性哈维氏弧菌进行人工感染试验,对斜带石斑鱼的免疫保护率分别为85%、80%。表明其具有免疫保护效应。

关键词：哈维氏弧菌 ORF 序列相似性副溶血弧菌斜带石斑鱼溶藻弧菌硫转移免疫作用

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溶藻弧菌HY9901摄铁系统相关基因的克隆与原核表达

溶藻弧菌HY9901摄铁系统相关基因的克隆与原核表达

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中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会

作者：薛丽丽庞欢瑛简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室仲恺农业工程学院

为研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901摄铁系统相关蛋白作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的溶藻弧菌HY9901血红素结合蛋白(Periplasmidc Hemin-Binding Protein,HutB)、铁载体运输系统转运蛋白(Ferric siderophore transport system,biopolymer transport protein ExbB1、ExbB2)的序列,分别设计3对带酶切位点的引物,PCR扩增HutB、ExbB1、ExbB2基因。然后对HutB基因经过酶切、连接等步骤,构建了HutB的原核表达载体pET-HutB,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,并对其IPTG浓度、诱导时间、温度、洗脱浓度进行优化,以期获得较大量的目的蛋白。结果表明:IPTG诱导后经SDS-PAGE与Western-blot分析,成功表达了溶藻弧菌HY9901血红素结合蛋白HutB,分子量为30.69ku与预期相符,且表达的蛋白以包涵体的形式存在,HutB蛋白在大肠杆菌中诱导表达的优化条件为:0.4mmol/LIPTG,37℃诱导4h;最佳咪唑洗脱浓度为400mm/L。这些结果为进一步研究目的蛋白的免疫原性和疫苗制备奠定基础。

关键词：溶藻弧菌 HutB、ExbB1、ExbB2基因克隆原核表达

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溶藻弧菌HY9901摄铁系统相关基因的克隆与原核表达

溶藻弧菌HY9901摄铁系统相关基因的克隆与原核表达

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2013年环北部湾高校研究生海洋论坛

作者：薛丽丽庞欢瑛简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江 524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江 524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江 524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江 524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江 524088 仲恺农业工程学院广东广州 510225

为研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901摄铁系统相关蛋白作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的溶藻弧菌HY9901血红素结合蛋白(Periplasmidc Hemin-Binding Protein,HutB)、铁载体运输系统转运蛋白(Ferric siderophore transport system, biopolymer transport protein ExbB1、ExbB2)的序列,分别设计3对带酶切位点的引物,PCR扩增HutB、ExbB1、ExbB2基因.然后对HutB基因经过酶切、连接等步骤,构建了HutB的原核表达载体pET-HutB,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,并对其IPTG浓度、诱导时间、温度、洗脱浓度进行优化,以期获得较大量的目的蛋白.结果表明：IPTG诱导后经SDS-PAGE与Western-blot分析,成功表达了溶藻弧菌HY9901血红素结合蛋白HutB,分子量为30.69ku与预期相符,且表达的蛋白以包涵体的形式存在,HutB蛋白在大肠杆菌中诱导表达的优化条件为：0.4mmol/LIPTG,37℃诱导4h;最佳咪唑洗脱浓度为400mm/L.这些结果为进一步研究目的蛋白的免疫原性和疫苗制备奠定基础.

关键词：溶藻弧菌 HutB ExbB1 ExbB2基因克隆原核表达

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