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2008年中国水产学会学术年会

作者：梁海鹰吴灶和简纪常鲁义善广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室

参照基因库上登录的弧菌鞭毛丝蛋白FlaB基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的FlaB全基因,并克隆到pMD19-T载体中测序,经序列分析该基因全长1134bp,编码377个氨基酸,与基因库中其他弧菌的同源基因序列比较显示,溶藻弧菌FlaB基因... 详细信息

参照基因库上登录的弧菌鞭毛丝蛋白FlaB基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的FlaB全基因,并克隆到pMD19-T载体中测序,经序列分析该基因全长1134bp,编码377个氨基酸,与基因库中其他弧菌的同源基因序列比较显示,溶藻弧菌FlaB基因与副溶血弧菌FlaB基因的同源性最高(92%)。将该基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中超量表达出带His-tag的融合蛋白,大小与预期分子量一致,而未经IPTG诱导的重组菌和空载体没有得到表达。优化表达条件,纯化融合蛋白,将此蛋白免疫SPF级小鼠制备了多克隆抗血清。Westemblot结果表明鼠抗FlaB血清与FlaB重组蛋白发生免疫反应,免疫条带和预期的带His-Tag的FlaB重组蛋白大小一致。为下一步进行融合蛋白免疫原性的比较研究以及疫苗的制备奠定了基础。

关键词：溶藻弧菌鞭毛蛋白 FlaB 原核表达

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凡纳滨对虾生态养殖高位池优势菌群及其部分生物学特性的研究

凡纳滨对虾生态养殖高位池优势菌群及其部分生物学特性的研究

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全国畜禽和水产养殖污染监测与控制治理技术交流研讨会

作者：丁燏简纪常吴灶和广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东海洋大学水产学院

优势菌群在对虾养殖池具有较重要的地位,对维持对虾机体的正常生理状态和微生态平衡具有重要作用,并可以作为环境污染的指示菌。本文采用平板菌落计数法测定各微生物的数量;用有限稀释平板涂布法,分离纯化凡纳滨对虾养殖高位池水体的优... 详细信息

优势菌群在对虾养殖池具有较重要的地位,对维持对虾机体的正常生理状态和微生态平衡具有重要作用,并可以作为环境污染的指示菌。本文采用平板菌落计数法测定各微生物的数量;用有限稀释平板涂布法,分离纯化凡纳滨对虾养殖高位池水体的优势菌;用牛津杯法测定这些菌株对致病性溶藻弧菌(Vibrio Alginolyticus)的抑制效果,以筛选弧菌拮抗菌,并测定拮抗菌的部分特性。结果显示,凡纳滨对虾养殖高位池水体异养菌平均总量为9.76×104 CFU/mL;真菌平均总量为7.89×103 CFU/mL;放线菌平均总量为2.84×103 CFU/mL。从各取样点水体分离纯化得到16株优势菌,并从其中筛选出4株对溶藻弧菌有抑制作用的菌株(DY1、DY2、DY4、DE1),菌株DE1对致病菌溶藻弧菌具有较强的抑制作用,而DY1、DY2和DY4等3株菌的抑菌活性较弱。菌株DE1为革兰氏阴性短杆菌,具有运动性,最适生长pH5～9,氧化酶反应阳性,发酵产酸,并可以利用吐温40、吐温80、L-阿拉伯糖、甲基丙酮酸等四种BIOLOG系统阴性鉴定板中的碳源,但不能用BIOLOG系统进行鉴定。有望通过更深入的研究,将拮抗菌DE1开发成微生态制剂应用于对虾的养殖业,有效地维持生态平衡,阻止疾病的暴发。

关键词：凡纳滨对虾拮抗细菌优势菌群生物学特性

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溶藻弧菌外膜蛋白W基因及克隆表达

溶藻弧菌外膜蛋白W基因及克隆表达

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2008年中国水产学会学术年会

作者：王秀英吴灶和简纪常鲁义善广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室

根据溶藻弧菌外膜蛋白W基因的保守序列设计引物,扩增溶藻弧菌外膜蛋白W的主要区域,再根据该序列两端分别设计三个嵌套的特异性引物,与随机引物组合进行热不对称交错PCR(TAIL-PCR)。经三次热不对称交错PCR后,成功扩增出外膜蛋白W完整开... 详细信息

根据溶藻弧菌外膜蛋白W基因的保守序列设计引物,扩增溶藻弧菌外膜蛋白W的主要区域,再根据该序列两端分别设计三个嵌套的特异性引物,与随机引物组合进行热不对称交错PCR(TAIL-PCR)。经三次热不对称交错PCR后,成功扩增出外膜蛋白W完整开放阅读框,测序分析表明该外膜蛋白W的开放阅读框长度为645bp,与GenBank中登录的DQ075316.1,AY944132.1同源性分别为99%,90%。该基因编码214个氨基酸,其信号肽含有22个氨基酸残基。通过基因重组构建原核表达载体PET-OMPW,转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明诱导的目的蛋白约为23KD,与理论推导的一致。该基因的氨基酸序列同登录号为AAY86764.1的溶藻弧菌的同源性为95%,与发光菌属和哈维氏弧菌的同源性分别为92%和86%。实验结果表明,溶藻弧菌外膜蛋白W与其它弧菌属外膜蛋白具有较高同源性,可以作为研制DNA疫苗的抗原基因,为进一步研究DNA疫苗提供理论依据。

关键词：溶藻弧菌外膜蛋白 TAIL-PCR 原核表达

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十二烷基苯磺酸钠对奥尼罗非鱼免疫毒性的研究

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南方水产 2008年第3期4卷 33-37页

作者：余坦健简纪常林兴简贺君黄郁葱广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524025 福建省康地饲料开发有限公司福建福州350007

用5种浓度的十二烷基苯磺酸钠(sodiumdodecyl benzene sulfonic,SDBS)浸泡刺激奥尼罗非鱼(Tilapianilotica♀×***♂)8周,每2周采血样1次,测定免疫指标。0.05和0.10mg·L-1组对奥尼罗非鱼的氯化硝基四氮唑兰(nitro blue tetrazo... 详细信息

用5种浓度的十二烷基苯磺酸钠(sodiumdodecyl benzene sulfonic,SDBS)浸泡刺激奥尼罗非鱼(Tilapianilotica♀×***♂)8周,每2周采血样1次,测定免疫指标。0.05和0.10mg·L-1组对奥尼罗非鱼的氯化硝基四氮唑兰(nitro blue tetrazolium,NBT)阳性细胞和IgM含量无影响。0.40mg·L-1组在第8周时,IgM含量显著下降,而NBT阳性细胞突然急剧下降,与对照组相比差异极显著。0.70mg·L-1组从第4周起,NBT阳性细胞和IgM含量开始减少,第6周时差异显著。1.00mg·L-1组NBT阳性细胞数在第2周时量就已经有减少,但与对照组相比差异不显著,到第4周时差异极其显著;在第4周时IgM含量有显著差异,第6周后差异极显著。攻毒试验表明,0.40、0.70和1.00mg·L-1组的死亡率均高于对照组。以上结果表明,当SDBS浓度大于0.40mg·L-1时,奥尼罗非鱼免疫功能不同程度受到抑制,对NBT阳性细胞和IgM的影响存在着时间与剂量效应。

关键词：十二烷基苯磺酸钠(SDBS) 奥尼罗非鱼免疫指标 NBT阳性细胞 IgM

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斜带石斑鱼MHCⅠ分子克隆、基因组构造与表达分析

斜带石斑鱼MHCⅠ分子克隆、基因组构造与表达分析

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2008年中国水产学会学术年会

作者：李楠夏春吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室中国农业大学

主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)可以和抗原多肽与β2微球蛋白(β2m)结合,将抗原肽递呈到细胞表面,被CTL细胞的TCR识别,诱导机体产生细胞免疫应答。本研究首先建立了斜带石斑鱼溶藻弧菌疫苗免疫前和免疫后的cDNA文库。采用同源克隆和末... 详细信息

主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)可以和抗原多肽与β2微球蛋白(β2m)结合,将抗原肽递呈到细胞表面,被CTL细胞的TCR识别,诱导机体产生细胞免疫应答。本研究首先建立了斜带石斑鱼溶藻弧菌疫苗免疫前和免疫后的cDNA文库。采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法,得到1984 bp的斜带石斑鱼MHCⅠα全长cDNA片段,和792 bp的β2m全长cDNA片段。MHCⅠ全长cDNA序列包括1192 bp的开放阅读框(ORF),453 bp的5'末端非编码区(UTR)以及339 bp的3'末端非编码区。β2m全长cDNA序列包括354bp的开放阅读框(ORF),87 bp的5'末端非编码区(UTR)以及117 bp的3'末端非编码区。利用DNAMan和MEGA 3.0软件进行MHCⅠα基因的氨基酸序列比对和同源性比较,结果表明,斜带石斑鱼MHCⅠα与其它硬骨鱼类在氨基酸水平的同源率为44.74%-72.51%。同时,设计特异性引物对β2m基因组进行PCR扩增,得到2520bp的基因组序列。应用Real-Time PCR分析其组织表达发现MHCⅠα基因在正常斜带石斑鱼组织中均表达,但表达量在各个组织中有差异。

关键词：斜带石斑鱼 MHC I 克隆 Real-Time PCR

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应用RD-PCR技术构建溶藻弧菌的cDNA文库

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水产学报 2007年第6期31卷 731-736页

作者：王蓓吴灶和简纪常鲁义善广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江 524025

应用限制性显示PCR（RD-PCR）技术构建溶藻弧菌poly（A）化mRNA的cDNA文库,筛选,收集巧妙地解决了由于细菌mRNA poly（A）化位点的高度多态性、用常规方法构建原核cDNA文库所遇到的文库大量重复冗余的难题。并进行筛选、收集cDNA片段进... 详细信息

应用限制性显示PCR（RD-PCR）技术构建溶藻弧菌poly（A）化mRNA的cDNA文库,筛选,收集巧妙地解决了由于细菌mRNA poly（A）化位点的高度多态性、用常规方法构建原核cDNA文库所遇到的文库大量重复冗余的难题。并进行筛选、收集cDNA片段进行测序,根据测序结果进行生物信息学分析和结果验证。实验结果表明,我们成功地构建了溶藻弧菌poly （A）化mRNA的cDNA文库,获得一百多个基因片段并对其中53个基因片段进行测序分析,获得了如细菌Ⅲ型分泌系统易位蛋白、趋药性传感器、类丝氨酸蛋白酶等毒力相关因子的基因片断。并且在一定程度上证实了poly（A）化在细菌中不是个别和偶然的现象。实验结果说明了我们所构建的溶藻弧菌poly（A）化mRNA的cDNA文库质量高,文库基因片段的重复性低,筛选基因片段效率高、目的性强。本文并探讨了限制性显示PCR技术在细菌poly（A）化mRNA的cDNA1文库构建中的应用价值。

关键词：溶藻弧菌 cDNA文库限制性显示PCR

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南极硅藻GJ01谷胱甘肽合成酶法生产谷胱甘肽

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中国水产科学 2007年第5期14卷 829-835页

作者：丁燏缪锦来唐啸尘李光友简纪常吴灶和广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东海洋大学水产学院广东湛江524025 国家海洋局第一海洋研究所海洋生物活性物质重点实验室山东青岛266061

以南极微藻中的南极硅藻GJ01(Berkeleya rutilansGJ01)为材料,采用分光光度法研究谷胱甘肽的前体氨基酸等因子对谷胱甘肽合成酶的影响,并在少量可供应ATP的南极硅藻GJ01细胞存在的情况下,对其游离谷胱甘肽合成酶合成谷胱甘肽的条件进行... 详细信息

以南极微藻中的南极硅藻GJ01(Berkeleya rutilansGJ01)为材料,采用分光光度法研究谷胱甘肽的前体氨基酸等因子对谷胱甘肽合成酶的影响,并在少量可供应ATP的南极硅藻GJ01细胞存在的情况下,对其游离谷胱甘肽合成酶合成谷胱甘肽的条件进行优化。结果表明,南极硅藻GJ01谷胱甘肽合成酶的最适温度为10～25℃,最适pH值为7.0;Glu、Cys、Gly的最适浓度分别为24 mmol.L-1、12 mmol.L-18、mmol.L-1。此外Met对谷胱甘肽的合成也有影响,而且南极硅藻GJ01的谷胱甘肽合成酶还具有Mg2+依赖性。正交实验表明,南极硅藻GJ01游离谷胱甘肽合成酶,产生谷胱甘肽的最理想条件为,温度30℃、Cys浓度10 mmol.L-1、Mg2+浓度30 mmol.L-1、pH 7.5。该方法用于工业化生产谷胱甘肽是可行的。

关键词：南极硅藻GJ01 谷胱甘肽谷胱甘肽合成酶法优化条件

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盐度对卵形鲳鲹幼鱼生长及能量收支的影响

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广东海洋大学学报 2007年第4期27卷 30-34页

作者：黄建盛陈刚杨健张健东施钢周晖汤保贵广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524025

在水温(28±1)℃,以配合饲料及最大摄食量的条件下,研究卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)幼鱼[初始体重(5.77±0.45)g]在盐度10、15、20、25、30和35下的生长及能量收支。结果表明:在盐度25时,湿重、干重、蛋白质及能量指标的特定... 详细信息

在水温(28±1)℃,以配合饲料及最大摄食量的条件下,研究卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)幼鱼[初始体重(5.77±0.45)g]在盐度10、15、20、25、30和35下的生长及能量收支。结果表明:在盐度25时,湿重、干重、蛋白质及能量指标的特定生长率均达到最大值,分别为3.21%、2.06%、4.76%和4.66%;干重、蛋白质和能量指标的摄食率也达最大,分别为20.31%、13.57%和12.21%;干重、蛋白质和能量指标的转化效率也达最大,分别为35.61%、46.60%和52.78%。可见,盐度对卵形鲳鲹幼鱼的特定生长率、摄食率、转化效率及能量收支有显著影响。盐度对吸收效率则无显著影响,蛋白质和能量的平均吸收效率分别为94.91%和92.45%;在盐度25,卵形鲳鲹幼鱼得到最佳的能量分配模式,其收支方程为:100.00C=7.30F+10.13U+29.80R+52.77G。

关键词：卵形鲳骖幼鱼生长能量收支盐度影响

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饥饿和再投喂对尼罗罗非鱼蛋白酶活性的影响

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广东海洋大学学报 2007年第4期27卷 11-15页

作者：侯凤霞张健东叶富良陈刚周晖施刚汤保贵广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524025

测定了饥饿和再投喂的尼罗罗非鱼胃、肠、肝胰脏蛋白酶活性。结果表明:(1)尼罗罗非鱼蛋白酶的活性以胃为最高,肠为最低,且胃蛋白酶的活性极显著高于肠、肝胰脏(P0.05);(2)饥饿后,蛋白酶活性呈降低的趋势,饥饿处理25d后,胃、肠、肝胰脏... 详细信息

测定了饥饿和再投喂的尼罗罗非鱼胃、肠、肝胰脏蛋白酶活性。结果表明:(1)尼罗罗非鱼蛋白酶的活性以胃为最高,肠为最低,且胃蛋白酶的活性极显著高于肠、肝胰脏(P<0.01),肠和肝胰脏之间差异不显著(P>0.05);(2)饥饿后,蛋白酶活性呈降低的趋势,饥饿处理25d后,胃、肠、肝胰脏的蛋白酶活力分别降低到饥饿处理前的42.7%、41.0%、61.5%,均与对照组差异极显著(P<0.01);(3)再投喂后,饥俄15d以内的鱼蛋白酶活性上升迅速,经过15d恢复投喂,基本上就恢复到了正常水平,且消化酶活性甚至高于一直投喂对照组,而饥饿20、25d的鱼蛋白酶活性虽缓慢上升,但仍无法恢复到正常水平,与对照组差异显著(P<0.05)。

关键词：尼罗罗非鱼饥饿再投喂蛋白酶

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温度和盐度对军曹鱼幼鱼生长与抗氧化酶活性的影响

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广东海洋大学学报 2007年第4期27卷 25-29页

作者：杨健陈刚黄建盛张健东施钢汤保贵周晖广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524025

在实验室条件下,采用两因素交叉分组的方法,初步研究了环境因子(温度和盐度)对军曹鱼幼鱼肌肉抗氧化酶比活力的影响。温度设3个水平(26、29、32),盐度设4个水平(11、19、27、35),两个因素按其各自水平共产生12种组合。军曹鱼幼鱼在玻璃... 详细信息

在实验室条件下,采用两因素交叉分组的方法,初步研究了环境因子(温度和盐度)对军曹鱼幼鱼肌肉抗氧化酶比活力的影响。温度设3个水平(26、29、32),盐度设4个水平(11、19、27、35),两个因素按其各自水平共产生12种组合。军曹鱼幼鱼在玻璃钢水槽内养殖20d后取样测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的比活力。结果表明:盐度因子诱导了军曹鱼的抗氧化应激反应,抗氧化酶活力随盐度降低而升高,SOD、CAT和GPX比活力分别从35时的17.74±3.38、19.44±2.66和13.70±2.99U/mg上升到11时的30.14±1.76、35.63±10.59和17.44±4.32U/mg;温度、盐度及因素间的交互作用对SOD和CAT比活力有显著影响(P<0.05);温度对GPX比活力无显著影响(P>0.05),而盐度及因素间的交互作用对GPX比活力影响显著(P<0.05)。

关键词：军曹鱼抗氧化酶温度盐度

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