检索结果-内蒙古大学图书馆

微生物学通报 2012年第11期39卷 1560-1572页

作者：陈晓洁曾永辉简纪常鲁义善吴灶和广东海洋大学水产学院、广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524025 仲恺农业工程学院广东广州510000

【目的】湖光岩玛珥湖是一类特殊的火山口湖,它完全封闭,地质年代久远,尚未受人类活动的剧烈影响,孕育着丰富而特殊的微生物种群。好氧不产氧光合细菌(AAPB)是以其在有氧情况下能行使光合功能而定义的一类专性异养细菌,其生理生态特征独... 详细信息

【目的】湖光岩玛珥湖是一类特殊的火山口湖,它完全封闭,地质年代久远,尚未受人类活动的剧烈影响,孕育着丰富而特殊的微生物种群。好氧不产氧光合细菌(AAPB)是以其在有氧情况下能行使光合功能而定义的一类专性异养细菌,其生理生态特征独特,进化年代久远,在水生生态系统的上层水体中广泛分布。目前,AAPB在玛珥湖水体中是否有分布仍是未知。【方法】构建和比较夏季湖水1 m、5 m、12 m三个水层的总DNA和总RNA的AAPB光合中心合成的关键基因pufM的6个克隆文库,并结合定量PCR技术,分析了不同水层AAPB的分布、系统发育多样性及其在总细菌中的比重。【结果】6个文库覆盖率和稀释曲线显示样本初步揭示了各水层优势AAPB类群的多样性。BLAST核苷酸同源性介于80%93%;多样性指数表明,湖光岩表层和底层多样性相当,中间层最低,总RNA的多样性高于总DNA。系统发育分析结果表明,OTU21 24所含的序列(占总序列的49.43%)与β-变形细菌的进化距离最接近,是湖光岩玛珥湖的优势AAPB菌群。定量PCR结果显示1 m水层中AAPB在总细菌中的比重最高,可达38.06%;而5 m水层中AAPB所占的比重最低,仅为0.85%;12 m为9.54%。【结论】湖光岩玛珥湖孕育着丰富而多样的AAPB类群。

关键词：湖光岩玛珥湖好氧不产氧光合细菌 pufM 多样性荧光定量PCR 系统发育分析

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罗非鱼源无乳链球菌溶血素基因体外表达及其免疫原性

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渔业科学进展 2014年第6期35卷 60-67页

作者：王蓓李桂欢王培汤菊芬鲁义善吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin,Hly)对鱼体的免疫保护作用,根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因,定向克隆于原核表达载体p ET-28a中,构建原核重组质粒p ET-28a-hly,经IPTG诱导表达后,制成亚单位... 详细信息

为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin,Hly)对鱼体的免疫保护作用,根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因,定向克隆于原核表达载体p ET-28a中,构建原核重组质粒p ET-28a-hly,经IPTG诱导表达后,制成亚单位疫苗免疫吉富罗非鱼,并分析疫苗的免疫保护力。结果显示,hly基因产物大小1335 bp,编码444个氨基酸,经测序与Gen Bank报道的链球菌属Hly氨基酸序列同源性可达99%。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见一条51.7 k D的特异条带;Western blotting分析结果说明表达的Hly蛋白能与His-Tag单抗特异性结合;制备的亚单位疫苗免疫鱼体后第14天即可检测到抗体产生,并在第28天达到峰值,抗体效价为1∶4096,免疫保护率为70%。由此证实,该亚单位疫苗有望成为预防由无乳链球菌引起的罗非鱼链球菌病的基因工程类疫苗。

关键词：无乳链球菌溶血素原核表达免疫原性

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吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达

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生物技术通报 2014年第7期30卷 137-142页

作者：王蓓李桂欢鲁义善汤菊芬黄郁葱吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

利用重叠延伸(SOEing)PCR技术,将吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQ0910株表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因通过Linker序列融合,构建成为Sip-GAPDH融合基因。将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明,重组质粒pET-32a-Sip-GAPDH在大肠杆菌BL21(DE3)中表达后所获得的融合蛋白Sip-GAPDH分子量为102.01 kD,表达最佳条件为37℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导5 h。Western blot鉴定结果表明融合基因得到了成功表达。

关键词：无乳链球菌 Sip-GAPDH融合基因重叠延伸PCR技术原核表达

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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)NCCRP-1基因的克隆和原核表达

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生物技术通报 2013年第11期29卷 105-111页

作者：蔡佳代礼平王蓓汤菊芬黄郁葱鲁义善吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

应用RACE PCR克隆了草鱼NCCRP-1基因。结果表明,NCCRP-1cDNA全长900 bp,开放阅读框为714 bp,编码237个氨基酸残基,预测分子量为27.3 kD,理论等电点为5.63。草鱼NCCRP-1具有NCCRP-1蛋白家族保守的功能区域,与鲤鱼该基因(Cyprinus carpio... 详细信息

应用RACE PCR克隆了草鱼NCCRP-1基因。结果表明,NCCRP-1cDNA全长900 bp,开放阅读框为714 bp,编码237个氨基酸残基,预测分子量为27.3 kD,理论等电点为5.63。草鱼NCCRP-1具有NCCRP-1蛋白家族保守的功能区域,与鲤鱼该基因(Cyprinus carpioL.)的相似性为88%。将此基因定向插入原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-NCCRP后转化BL2(1DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE分析显示在47.8 kD处出现特异性蛋白条带,Western blot检测表明草鱼NCCRP-1融合蛋白成功表达。

关键词：草鱼 NCCRP-1 克隆原核表达

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无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的克隆及原核表达

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生物技术通报 2014年第2期30卷 116-123页

作者：王培鲁义善王蓓汤菊芬蔡佳吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

以灭活的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)诱导后的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼(***)分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列并对... 详细信息

以灭活的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)诱导后的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼(***)分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。sIgM基因cDNA全长为1 921 bp,开放阅读框(ORF)为1 740 bp,5'端非编码区(5'-UTR)41 bp,3'端非编码区(3'-UTR)140 bp,编码579个氨基酸,N端有信号肽结构。预测分子量(MW)为64.26 kD,理论等电点(pI)为5.36。系统进化树分析显示,吉富罗非鱼(***)sIgM与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)的亲缘关系较近。sIgM基因有4个恒定区。将吉富罗非鱼(***)sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-sIgM,诱导表达后确定最优条件为37℃条件下,IPTG浓度为0.05 mmol/L时诱导4 h蛋白表达量最大。纯化蛋白后经Western blot分析,sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合,表明目的蛋白成功表达。

关键词：吉富罗非鱼免疫球蛋白M 基因克隆原核表达蛋白免疫印迹

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鰤鱼诺卡氏菌HYD基因的克隆及亚细胞定位研究

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南方水产科学 2018年第1期14卷 35-42页

作者：陈建林苏泽杰鲁义善徐亮张红莲夏立群广东海洋大学深圳研究院广东深圳518108 广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088

鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是鱼类诺卡氏菌病的主要病原。鰤鱼诺卡氏菌水解酶(hydrolase,HYD)可能是鰤鱼诺卡氏菌的毒力因子。研究结果表明鰤鱼诺卡氏菌HYD的肽段不是分泌蛋白。亚细胞定位研究发现HYD-GFP融合蛋白均匀地分布在胖... 详细信息

鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是鱼类诺卡氏菌病的主要病原。鰤鱼诺卡氏菌水解酶(hydrolase,HYD)可能是鰤鱼诺卡氏菌的毒力因子。研究结果表明鰤鱼诺卡氏菌HYD的肽段不是分泌蛋白。亚细胞定位研究发现HYD-GFP融合蛋白均匀地分布在胖头鲤(FHM)细胞的细胞质中。亚细胞定位和过表达研究都显示HYD蛋白在FHM细胞中表达后,细胞核出现固缩浓染、凋亡小体等细胞凋亡特征,但Caspase-3活性检测表明HYD并未显著增加细胞凋亡水平。研究为进一步了解鰤鱼诺卡氏菌的致病机理奠定了基础。

关键词：鰤鱼诺卡氏菌水解酶亚细胞定位 Caspase-3活性检测

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罗非鱼源无乳链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与原核表达

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水产科学 2014年第3期33卷 175-180页

作者：李桂欢王蓓鲁义善汤菊芬黄郁葱吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

为对罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910株甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因进行克隆及表达进行研究,根据GenBank上已登录的相关基因设计引物,采用PCR方法扩增该株细菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因,然后将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌B... 详细信息

为对罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910株甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因进行克隆及表达进行研究,根据GenBank上已登录的相关基因设计引物,采用PCR方法扩增该株细菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因,然后将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。结果显示,甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因有1011个碱基,编码336个氨基酸;同源基因序列比对显示,无乳链球菌ZQ0910株与无乳链球菌2603V/R的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的同源性最高;经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后,SDS-PAGE电泳显示甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白表达的最优条件为:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0.06mmol/L、温度37℃、诱导5h,蛋白表达量最大;HisTrap HP柱纯化后融合蛋白的质量浓度为560μg/mL;Western Blot验证甘油醛-3-磷酸脱氢酶的分子量为36.01ku。研究结果表明,成功克隆与表达了甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因,这将为进一步研究甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫原性及亚单位疫苗提供理论依据。

关键词：无乳链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆原核表达

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海水氨氧化细菌菌种保存方法的研究

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水产科学 2011年第8期30卷 471-475页

作者：鲁义善郭青吴灶和简纪常钱鸣亮广东海洋大学水产学院广东湛江524025 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524025

将筛选得到的一株海水氨氧化细菌,振荡培养至氨氧化细菌对数增长期末期,去除珊瑚砂后对菌液进行分装保存,以研究其在室温、4℃、-18℃及-80℃的保存条件下存活率的变化。试验结果表明,该氨氧化细菌菌液不宜于-18℃保存,室温下保存不宜超... 详细信息

将筛选得到的一株海水氨氧化细菌,振荡培养至氨氧化细菌对数增长期末期,去除珊瑚砂后对菌液进行分装保存,以研究其在室温、4℃、-18℃及-80℃的保存条件下存活率的变化。试验结果表明,该氨氧化细菌菌液不宜于-18℃保存,室温下保存不宜超过3个月,4℃和-80℃,保存不宜超过6个月。10%的甘油对该氨氧化细菌有抗冻保护作用。但该氨氧化细菌在以珊瑚砂为载体进行保存时,4℃和-80℃,保存15个月后仍能转接成活,且硝化活力无明显下降。

关键词：海水氨氧化细菌保种存活率温度载体

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溶藻弧菌hutB基因的克隆及其在不同铁源下的表达分析

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上海海洋大学学报 2015年第2期24卷 190-195页

作者：庞欢瑛薛丽丽简纪常蔡双虎鲁义善吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

根据已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)血红素结合蛋白(Periplasmic Hemin-Binding Protein,HutB)基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的hutB基因,序列分析结果显示该基因全长870 bp,共编码289个氨基酸,分子量约为30.59 ku,PI为6.45。细胞定位、SignalP4.0、TMHMM Server 2.0和SoftB erry-Psite预测结果显示,hutB位于外周质中,存在信号肽切割位点,没有跨膜结构域,氨基酸序列含有1个cA MP和cG MP的蛋白激酶磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点等多个活性位点。系统进化树结果显示,溶藻弧菌hutB与坎氏弧菌(Vibrio campbellii)和哈氏弧菌(Vibrio harveyi)聚为一簇。qR T-PCR技术初步探究hutB在不同铁源下的表达量,结果表明,溶藻弧菌hutB在含有FeC l3的富铁培养基中,表达量与对照组相比差异不显著;在含有血红素的条件下表达量上调;在同时含有2-2'二联吡啶和血红素时上调极显著(P<0.01);在含2-2'二联吡啶的铁限制环境下,表达量下调极显著(P<0.01)。

关键词：溶藻弧菌 hutB基因血红素摄取

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我国华南地区罗非鱼源无乳链球菌分子流行病学研究

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水产科学 2014年第12期33卷 741-749页

作者：王蓓黎源陈贺李桂欢鲁义善汤菊芬蔡佳吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

为了解我国3个地区(广东省、广西省和海南省)罗非鱼源无乳链球菌临床株的遗传背景及进化关系,对2010—2011年间采集分离的128株链球菌,采用Bio-MerieuxVITEK进行生理生化分析和16SrRNA法鉴定菌株类型,并运用多位点序列分型技术,确定其... 详细信息

为了解我国3个地区(广东省、广西省和海南省)罗非鱼源无乳链球菌临床株的遗传背景及进化关系,对2010—2011年间采集分离的128株链球菌,采用Bio-MerieuxVITEK进行生理生化分析和16SrRNA法鉴定菌株类型,并运用多位点序列分型技术,确定其等位基因谱型及菌株序列型。试验结果表明,通过对分离菌株的生理生化及16SrRNA基因进行分析,确认有104株为无乳链球菌,这104株分属1个已知克隆系ST-7和2个未知克隆系NST-1和NST-2,其中NST-1克隆系所占比列最多,占88.5%(92/104)。本研究结果揭示了我国南方3个地区无乳链球菌分离株呈多克隆系并存,以新型NST-1克隆系为主,应加强对新克隆系的病原学监测。应用MLST分子分型技术,初步揭示了我国南方3个地区罗非鱼源无乳链球菌的遗传进化关系。

关键词：无乳链球菌 16S rRNA基因多位点序列分析分子流行病学

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