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中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会

作者：薛丽丽庞欢瑛简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室仲恺农业工程学院

为研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901摄铁系统相关蛋白作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的溶藻弧菌HY9901血红素结合蛋白(Periplasmidc Hemin-Binding Protein,HutB)、铁载体运输系统转运蛋白(Ferric siderophore transport system,biopolymer transport protein ExbB1、ExbB2)的序列,分别设计3对带酶切位点的引物,PCR扩增HutB、ExbB1、ExbB2基因。然后对HutB基因经过酶切、连接等步骤,构建了HutB的原核表达载体pET-HutB,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,并对其IPTG浓度、诱导时间、温度、洗脱浓度进行优化,以期获得较大量的目的蛋白。结果表明:IPTG诱导后经SDS-PAGE与Western-blot分析,成功表达了溶藻弧菌HY9901血红素结合蛋白HutB,分子量为30.69ku与预期相符,且表达的蛋白以包涵体的形式存在,HutB蛋白在大肠杆菌中诱导表达的优化条件为:0.4mmol/LIPTG,37℃诱导4h;最佳咪唑洗脱浓度为400mm/L。这些结果为进一步研究目的蛋白的免疫原性和疫苗制备奠定基础。

关键词：溶藻弧菌 HutB、ExbB1、ExbB2基因克隆原核表达

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溶藻弧菌HY9901摄铁系统相关基因的克隆与原核表达

溶藻弧菌HY9901摄铁系统相关基因的克隆与原核表达

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2013年环北部湾高校研究生海洋论坛

作者：薛丽丽庞欢瑛简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江 524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江 524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江 524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江 524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江 524088 仲恺农业工程学院广东广州 510225

为研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901摄铁系统相关蛋白作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的溶藻弧菌HY9901血红素结合蛋白(Periplasmidc Hemin-Binding Protein,HutB)、铁载体运输系统转运蛋白(Ferric siderophore transport system, biopolymer transport protein ExbB1、ExbB2)的序列,分别设计3对带酶切位点的引物,PCR扩增HutB、ExbB1、ExbB2基因.然后对HutB基因经过酶切、连接等步骤,构建了HutB的原核表达载体pET-HutB,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,并对其IPTG浓度、诱导时间、温度、洗脱浓度进行优化,以期获得较大量的目的蛋白.结果表明：IPTG诱导后经SDS-PAGE与Western-blot分析,成功表达了溶藻弧菌HY9901血红素结合蛋白HutB,分子量为30.69ku与预期相符,且表达的蛋白以包涵体的形式存在,HutB蛋白在大肠杆菌中诱导表达的优化条件为：0.4mmol/LIPTG,37℃诱导4h;最佳咪唑洗脱浓度为400mm/L.这些结果为进一步研究目的蛋白的免疫原性和疫苗制备奠定基础.

关键词：溶藻弧菌 HutB ExbB1 ExbB2基因克隆原核表达

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SIP-GAPDH融合基因的构建与原核表达

SIP-GAPDH融合基因的构建与原核表达

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2013年环北部湾高校研究生海洋论坛

作者：李桂欢王蓓鲁义善汤菊芬黄郁葱吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院广东湛江 524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江 524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江 524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江 524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江 524088 仲恺农业工程学院广东广州 510225

利用重叠延伸(SOEing)PCR技术,将罗非鱼病源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQ0910株SIP基因与GAPDH基因通过Linker序列融合,构建成为SIP-GAPDH融合基因.经BamH I/SalI双酶切后,定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达.结果显示,在37℃,IPTG浓度为0.1mmol/L,诱导5h时蛋白表达量最大.Western Blot验证了pET-32a-SIP-GAPDH融合基因的蛋白分子量为***-GAPDH融合基因的成功构建与原核表达将为研制罗非鱼源无乳链球菌亚单位疫苗提供理论依据.

关键词：罗非鱼无乳链球菌融合基因原核表达

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无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的克隆及表达

无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的克...

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2013年环北部湾高校研究生海洋论坛

作者：王培王蓓鲁义善蔡佳简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江 524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江 524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江 524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江 524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江 524088 仲恺农业工程学院广东广州 510225

以灭活的无乳链球菌诱导后的吉富罗非鱼为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆出吉富罗非鱼sIgM全长并对其进行生物信息学分析.sIgM基因cDNA全长为1921bp,开放阅读框(ORF)为1740bp,5'端非编码区(5'... 详细信息

以灭活的无乳链球菌诱导后的吉富罗非鱼为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆出吉富罗非鱼sIgM全长并对其进行生物信息学分析.sIgM基因cDNA全长为1921bp,开放阅读框(ORF)为1740bp,5'端非编码区(5'-UTR) 41bp,3'端非编码区(3'-UTR) 140bp,编码579个氨基酸.预测分子量(MW)为64.26ku,理论等电点(PI)为5.36.1-19个氨基酸为信号肽结构.系统进化树分析显示,吉富罗非鱼sIgM与牙鲆和军曹鱼的亲缘关系较近.sIgM基因有一个可变区(VH)、一个连接区段(JH)和四个恒定区,基本结构形式为Leader-VH-JH-CH1-CH2-CH3-CH4.利用RT-PCR技术对无乳链球菌诱导前后的吉富罗非鱼sIgM基因的组织分布状况进行分析,结果显示,在健康的罗非鱼体内,sIgM基因主要在罗非鱼头肾、脾脏、胸腺中表达,而经灭活的无乳链球菌免疫48h后,sIgM mRNA的表达量在所有组织中都发生上调.将罗非鱼sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-sIgM,诱导表达后确定最优条件为,37℃条件下,IPTG浓度为0.05mM时诱导4h蛋白表达量最大.纯化蛋白后,Western Blot分析,sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合,表明目的蛋白成功表达.

关键词：吉富罗非鱼免疫球蛋白M 基因克隆荧光定量PCR 原核表达

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氟苯尼考在美国红鱼体内的药代动力学及组织分布研究

氟苯尼考在美国红鱼体内的药代动力学及组织分布研究

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中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会

作者：黄月雄汤菊芬鲁义善简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室仲恺农业工程学院

目的:研究水温20±2℃、盐度为28的条件下,腹腔注射和口灌两种给药方式氟苯尼考在美国红鱼体内的组织分布和药代动力学特征。方法:单剂量10mg/(***)分别单次腹注和口灌甲砜霉素,取给药后9、15、30min和1、1.5、2、4、6、8、12、24... 详细信息

目的:研究水温20±2℃、盐度为28的条件下,腹腔注射和口灌两种给药方式氟苯尼考在美国红鱼体内的组织分布和药代动力学特征。方法:单剂量10mg/(***)分别单次腹注和口灌甲砜霉素,取给药后9、15、30min和1、1.5、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120h美国红鱼的血浆、肌肉、肝脏和肾脏,各组织中的药物浓度用HPLC-MS/MS测定,所得药时数据用DAS3.0软件分析。结果:美国红鱼腹注氟苯尼考后血浆的药时数据符合一级吸收二室模型;血药达峰时间(tp)为0.5h,血药质量浓度峰值(Cmax)为15.47μg/mL,药时曲线下面积(AUC)分别394.10mg/(L.h),消除半衰期(t1/2β)为45.39h;口灌氟苯尼考后血浆的药时数据符合一级吸收一室模型;血药达峰时间(tp)为2h,血药质量浓度峰值(Cmax)为6.31μg/mL,药时曲线下面积(AUC)分别136.21mg/(L.h),消除半衰期(t1/2)为12.08h;氟苯尼考在组织中分布较广,注射和灌服给药肌肉、肝脏和肾脏的Cmax分别为2.73和5.12μg/g、9.90和5.44μg/g、6.83和9.10μg/g,tp分别为4和4、0.5和1.5 h、1.5和4h,AUC分别120.01和157.37 mg/(L.h)、105.66和162.32 mg/(L.h)、157.06和213.32mg/(L.h);氟苯尼考在美国红鱼体内消除速度较慢,注射和灌服给药肌肉、肝脏和肾脏的t1/2β分别为39.22和38.53h、7.42和27.9h、148.25和14.85h。结论:氟苯尼考注射给药在美国红鱼体内的吸收快于口灌给药,腹注给药氟苯尼考除在肝脏中的消除快于口灌给药外,在血浆、肌肉和肾脏中的消除均慢于口灌给药。

关键词：氟苯尼考美国红鱼药代动力学组织分布

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溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB的原核表达及条件优化和纯化

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中国农学通报 2013年第11期29卷 55-59页

作者：周泽军庞欢瑛丁燏简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

为研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901转运蛋白TolB作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB序列(JQ846501),设计1对带酶切位点的引物,PCR扩增tolB基因,然后经酶切、连接等步骤,构建tolB基因的原核表... 详细信息

为研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901转运蛋白TolB作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB序列(JQ846501),设计1对带酶切位点的引物,PCR扩增tolB基因,然后经酶切、连接等步骤,构建tolB基因的原核表达载体pET-TolB,并对其IPTG浓度、诱导时间、温度、洗脱浓度进行优化,以期获得较大量的目的蛋白。结果表明:IPTG诱导后经SDS-PAGE与Western-blot分析,成功表达了溶藻弧菌HY9901株TolB蛋白,分子量与预期相符,且表达的蛋白以包涵体的形式存在;TolB蛋白在大肠杆菌中诱导表达的优化条件为:0.2mmol/L IPTG,37℃诱导4h;最佳咪唑洗脱浓度为400mmol/L。这些结果为进一步研究目的蛋白的免疫原性和疫苗制备奠定基础。

关键词：溶藻弧菌 tolB基因原核表达优化纯化

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红笛鲷主要组织相容性复合物Ⅰα抗原基因的克隆与表达分析

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水产学报 2012年第10期36卷 1482-1492页

作者：张新中鲁义善吴灶和简纪常广东海洋大学广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东海洋大学广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室仲恺农业工程学院

为研究红笛鲷免疫防御相关基因的作用机理和调控机制,实验应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)成功克隆了红笛鲷组织相容性复合物Ⅰα(MHCⅠα)抗原基因的全长cDNA序列,MHCⅠα的全长序列为1 369 bp,编码... 详细信息

为研究红笛鲷免疫防御相关基因的作用机理和调控机制,实验应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)成功克隆了红笛鲷组织相容性复合物Ⅰα(MHCⅠα)抗原基因的全长cDNA序列,MHCⅠα的全长序列为1 369 bp,编码354个氨基酸残基。BLAST分析显示,红笛鲷MHCⅠα与其他已知物种MHCⅠα基因的最高同源性为84%。构建的系统进化树显示,红笛鲷MHCⅠα与石斑鱼等MHCⅠα亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明,MHCⅠα在头肾中的最大表达量出现在哈氏弧菌ZJ0706诱导后6～15 h内;构建的重组表达质粒pET32a-MHCⅠα经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了正确表达。将纯化后的重组蛋白与佐剂混合后免疫新西兰纯种大白兔制备多克隆抗体。ELISA检测显示,所获得的兔抗血清效价约为1∶40 000。Western blot检测发现,本实验制备的抗血清能特异性地与重组蛋白发生抗原抗体反应。

关键词：红笛鲷主要组织相容性复合物Ⅰα(MHCⅠα) 原核表达克隆 cDNA末端快速扩增技术(RACE)

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哈维氏弧菌的分子遗传多样性研究

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水产学报 2012年第9期36卷 1450-1456页

作者：徐芝亮吴灶和简纪常黄郁葱广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东高等学校水产经济动物病害控制重点实验室仲恺农业工程学院

运用RAPD分型和BOX分型分子方法研究患病的海水鱼类体内和海水环境的101株哈维氏弧菌的分子遗传多样性。结果显示,从10个RAPD引物中发现只有PM2引物的分辨率和重复性较好,出现15条不同RAPD条带,在相似度65%下,101株哈维氏弧菌可以分为1... 详细信息

运用RAPD分型和BOX分型分子方法研究患病的海水鱼类体内和海水环境的101株哈维氏弧菌的分子遗传多样性。结果显示,从10个RAPD引物中发现只有PM2引物的分辨率和重复性较好,出现15条不同RAPD条带,在相似度65%下,101株哈维氏弧菌可以分为18种不同型;BOX分型出现20条不同的条带,在相似度为40%的情况下,可以把101株哈维式弧菌分15种不同的型;综合RAPD PM2和BOX分型,发现在相似度50%下,101株哈维氏弧菌可分18种型。综合RAPD和BOX分型数据可以很好地克服各自的缺点,得到更加准确的分型结果。

关键词：哈维氏弧菌海水鱼类 BOX分型 RAPD分型

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红笛鲷重组激活基因rag1原核表达条件的优化及纯化

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广东海洋大学学报 2012年第1期32卷 11-16页

作者：张雪利鲁义善谢吉国简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省高等学校水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524025

克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)RAG1蛋白(recombination activating protein1)活性核心区的基因序列,并与pET-28a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-28a-RAG1,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达。为提高融合蛋白的表达效率,运用传统的实验方法对诱导条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,在37℃条件下,利用0.1 mmol/L IPTG诱导8 h后,RAG1重组融合蛋白的表达量最大,相对分子质量与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式高效表达,利用His Trap HP亲和柱使其得到进一步纯化;Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,说明表达蛋白为目的蛋白。

关键词：红笛鲷 rag1基因原核表达表达条件优化纯化 Western blot分析

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卵形鲳鲹主要病害及其研究进展

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安徽农学通报 2012年第23期18卷 140-143,150页

作者：夏立群黄郁葱鲁义善广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088

综述了卵形鲳鲹养殖中常见的病原性疾病8种,其中病毒病1种,细菌病4种,寄生虫病3种;并对这8种疾病的病原体、发病症状、防治手段以及近年来的研究进展分别进行了详尽的论述;进而归纳了卵形鲳鲹常见疾病的综合防治措施,提出了未来卵形鲳... 详细信息

综述了卵形鲳鲹养殖中常见的病原性疾病8种,其中病毒病1种,细菌病4种,寄生虫病3种;并对这8种疾病的病原体、发病症状、防治手段以及近年来的研究进展分别进行了详尽的论述;进而归纳了卵形鲳鲹常见疾病的综合防治措施,提出了未来卵形鲳鲹病害研究的主要方向。

关键词：卵形鲳鲹病害综合防治

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