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尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)NCCRP-1在多种组织中表达的免疫组化研究

基因组学与应用生物学 2018年第6期37卷 2356-2360页

作者：郑琦黄瑜袁满蔡佳汤菊芬鲁义善吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

非特异性细胞毒性细胞（non-specific cytotoxic cell,NCC）是硬骨鱼中一类淋巴细胞,在非特异性免疫中通过上调炎症反应释放细胞因子发挥重要的作用,是哺乳动物中NK细胞的等价物。鱼类NCC在体内多个组织器官中均有分布,其细胞毒性是自发... 详细信息

非特异性细胞毒性细胞（non-specific cytotoxic cell,NCC）是硬骨鱼中一类淋巴细胞,在非特异性免疫中通过上调炎症反应释放细胞因子发挥重要的作用,是哺乳动物中NK细胞的等价物。鱼类NCC在体内多个组织器官中均有分布,其细胞毒性是自发的,可杀死多种靶细胞,例如同种异源或异种异源肿瘤细胞,寄生性原生动物和被病原侵染的细胞。NCCRP-1是NCC上的一种标志性受体。本研究对尼罗罗非鱼的脑,头肾,肝脏和脾脏进行切片,对NCCRP-1进行染色,通过免疫组化分析得知NCC在这些组织中的分布情况。另外采用Percoll非连续密度梯度法分离纯化得到头肾NCC,采用免疫组化染色和FITC标签标记,与组织中的染色结果分布相同。相较于qPCR等技术,本研究更直观地观察NCC在组织中的分布特点,为深入研究NCC的功能奠定了基础。

关键词：尼罗罗非鱼 NCCRP-1 免疫组化

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β-葡聚糖刺激下的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)转录组分析

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基因组学与应用生物学 2018年第1期37卷 219-228页

作者：张海艳鲁义善汪志文王蓓黄瑜简纪常广东海洋大学湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）是一种重要的海水经济养殖鱼类,然而病害是制约其养殖产量的一个重要因素。近年来-葡聚糖作为一种新型的天然免疫增强剂在水产养殖业中得到广泛应用。本研究采用腹腔注射0.2 mL-葡聚糖（浓度0.05 g/m... 详细信息

斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）是一种重要的海水经济养殖鱼类,然而病害是制约其养殖产量的一个重要因素。近年来-葡聚糖作为一种新型的天然免疫增强剂在水产养殖业中得到广泛应用。本研究采用腹腔注射0.2 mL-葡聚糖（浓度0.05 g/mL）刺激斜带石斑鱼,在刺激6 h、72 h后分别取头肾、血液淋巴细胞、胸腺和脾脏组织进行转录测序。结果一共组装了175 568条unigene,平均长度是1 507 bp。通过Blast比对数据库进行功能注释,一共注释了121 629条unigene。六大数据库注释得到的unigene数量分别为：91 955条（Nt）、66 089条（Nr）、14 126条（GO）、24 018条（COG）、9 673条（KEGG）和54 148条（Swiss Prot）。根据基因差异表达分析筛选出6类免疫相关的显著性差异基因71个,涉及抗原加工呈递、细胞粘附分子、补体系统、细胞因子、模式识别受体和吞噬作用。对差异基因进行GO富集分析,筛选出免疫相关条目7条,包括免疫应答、B细胞受体信号通路、趋化因子受体活性、白细胞趋化性、趋化因子调节信号通路、白细胞介素-1受体绑定和溶酶体组份。随机挑选7个显著性差异的免疫基因进行qRT-PCR验证,验证结果与测序结果变化趋势一致。本实验结果为研究-葡聚糖调节鱼类免疫系统的作用机制提供数据参考。

关键词：斜带石斑鱼 β-葡聚糖转录组 qRT-PCR

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尼罗罗非鱼CD247基因克隆及其组织表达分析

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广东海洋大学学报 2018年第6期38卷 6-12页

作者：樊博琳黎源汪志文鲁义善王蓓简纪常广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)CD247基因(Gen Bank登录号:MF975639;On-CD247),分析On-CD247的生物信息学特征及其在正常和经灭活无乳链球菌注射刺激的尼罗罗非鱼组织中的表达。【方法】设计CD247基因引物并对CD247基... 详细信息

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)CD247基因(Gen Bank登录号:MF975639;On-CD247),分析On-CD247的生物信息学特征及其在正常和经灭活无乳链球菌注射刺激的尼罗罗非鱼组织中的表达。【方法】设计CD247基因引物并对CD247基因片段进行扩增,运用荧光定量PCR技术分析尼罗罗非鱼CD247组织分布。【结果与结论】CD247基因编码区为453 bp,编码150个氨基酸,理论分子质量为16.9 ku,等电点为6.33,在跨膜区域有保守的ASP27、Asp35残基,胞内具有三段保守的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。On-CD247序列与红笛鲷(Lutjanus sanguineus)相似性最高,为74.0%,与其他鱼类的相似性介于35.8%～73.0%之间。On-CD247在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,其中在胸腺中表达量最高,其次是皮肤、肌肉、鳃,在头肾中表达量最低。经灭活无乳链球菌刺激后,On-CD247的表达量在胸腺、头肾和肠道中均显著上调,而在脾脏中却显著下调,且有明显的时序性。胸腺、头肾和肠道均在3 h表达量最高,脾脏在12 h表达量最低,头肾中的表达量也在12 h回落,表明On-CD247表达可被无乳链球菌所诱导。

关键词：尼罗罗非鱼 CD247 基因克隆组织表达无乳链球菌

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尼罗罗非鱼NCC活性调控蛋白的筛选鉴定与功能分析

尼罗罗非鱼NCC活性调控蛋白的筛选鉴定与功能分析

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2018年中国水产学会学术年会

作者：黄瑜汤菊芬蔡佳王蓓鲁义善简纪常广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室

非特异性细胞毒性细胞Ⅰ型受体(NCCRP-1)是非特异性细胞毒性细胞(NCC)发挥功能的重要受体蛋白。本研究以罗非鱼为研究对象,构建On-NCCRP-1酵母双杂交诱饵质粒,并构建罗非鱼头肾与肝脏酵母双杂交c DNA文库。利用诱饵载体分别从肝脏和头肾... 详细信息

非特异性细胞毒性细胞Ⅰ型受体(NCCRP-1)是非特异性细胞毒性细胞(NCC)发挥功能的重要受体蛋白。本研究以罗非鱼为研究对象,构建On-NCCRP-1酵母双杂交诱饵质粒,并构建罗非鱼头肾与肝脏酵母双杂交c DNA文库。利用诱饵载体分别从肝脏和头肾c DNA文库中筛选潜在互作蛋白。最终获取C-typelectin(On-C-typelectin)蛋白与On-NCCRP-1有潜在相互作用,并且克隆获得On-C-typelectin基因的ORF序列。点对点验证发现On-NCCRP-1与On-C-typelectin可相互作用。利用On-C-typelectin重组蛋白对体外分离的NCC进行刺激后,发现3 h和6 h均可诱导部分NCC毒性效应分子高表达,该结果表明NCC被激活。同时用诱导3 h的NCC对FHM细胞进行毒性实验,发现On-C-type lectin重组蛋白可有效诱导FHM细胞凋亡信号开启,而使用抗On-NCCRP-1抗体封闭On-NCCRP-1,可抑制NCC对FHM的杀伤活性。结果表明,On-C-type lectin可通过受体On-NCCRP-1介导NCC的杀伤活性。该研究为揭示鱼类NCC活性调控的作用网络及分子机理奠定了基础。

关键词：尼罗罗非鱼非特异性细胞毒性细胞非特异性细胞毒性细胞Ⅰ型受体 C-type lectin 活性调控

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尼罗罗非鱼CD80基因的分子克隆与mRNA表达分析

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基因组学与应用生物学 2017年第1期36卷 190-200页

作者：汪志文张海艳黄瑜鲁义善简纪常汤菊芬广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

CD80是T细胞活化和增殖过程中不可缺少的膜抗原,为T细胞的增殖分化提供必要的共刺激信号,在特异性细胞免疫过程中具有重要作用。本研究从罗非鱼脾脏组织中克隆获得CD80基因的编码区序列(Gen Bank登录号:KU884324;命名为On-CD80),该基因... 详细信息

CD80是T细胞活化和增殖过程中不可缺少的膜抗原,为T细胞的增殖分化提供必要的共刺激信号,在特异性细胞免疫过程中具有重要作用。本研究从罗非鱼脾脏组织中克隆获得CD80基因的编码区序列(Gen Bank登录号:KU884324;命名为On-CD80),该基因全长810 bp,可编码269个氨基酸,理论分子量为29.83 k D,等电点为5.97。氨基酸序列分析显示On-CD80具有2个保守的免疫球蛋白样结构域(Ig-like domain),5'端有一个典型的信号肽序列,3'端具有1个跨膜结构域。系统进化树中罗非鱼与伯氏朴丽鱼CD80蛋白聚为一支,显示了较高的同源性。荧光定量PCR分析显示,On-CD80在健康尼罗罗非鱼组织中均有表达,且在脾脏组织中表达量最高。经灭活的无乳链球菌免疫后,On-CD80在肾脏、脾脏、胸腺、肠道、鳃、脑组织中的表达量均显著上调,且表现出较为明显的时间依赖性表达模式,肠道、鳃和脑分别在8 h、24 h出现表达高峰,并于48 h、96 h再次出现表达高峰。脾脏和肾脏、胸腺的On-CD80表达则分别是在48 h、72 h达到表达高峰。综上所述,On-CD80表达能被无乳链球菌所诱导,提示该分子可能参与罗非鱼的抗菌免疫应答,该结果为进一步研究On-CD80在罗非鱼感染无乳链球菌过程中的作用奠定了一定的基础。

关键词：尼罗罗非鱼 CD80 无乳链球菌 mRNA表达分析

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斜带石斑鱼肠道乳酸菌的分离、鉴定及特性研究

斜带石斑鱼肠道乳酸菌的分离、鉴定及特性研究

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广东水产学会首届青年科技论坛

作者：伍元植广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨水产经济动物病害控制广东省普通高等学校重点实验室广东湛江524088

从健康斜带石斑鱼肠道中分离出3株形态特征不同的菌株,经革兰氏染色、氧化酶及触酶反应筛选出3株革兰氏阳性球菌,通过生化鉴定和16S rRNA测序结果发现他们分别为粪肠球菌、乳酸片球菌和乳酸乳球菌,命名为WYZ-1、WYZ-2和WYZ-3.选取嗜水... 详细信息

从健康斜带石斑鱼肠道中分离出3株形态特征不同的菌株,经革兰氏染色、氧化酶及触酶反应筛选出3株革兰氏阳性球菌,通过生化鉴定和16S rRNA测序结果发现他们分别为粪肠球菌、乳酸片球菌和乳酸乳球菌,命名为WYZ-1、WYZ-2和WYZ-3.选取嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌以及大肠杆菌以琼脂扩散法测定WYZ-1、WYZ-2和WYZ-3的抑菌活性,结果表明WYZ-3对大肠杆菌无抑制作用,对溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌和嗜水气单胞菌都有较显著的抑制作用,其中对溶藻弧菌和副溶血弧菌抑菌效果最好,抑菌直径为21.5-23.5mm;粪肠球菌和乳酸片球菌均对5种致病菌有抑制作用,抑菌直径为9.5-22.5mm.利用药敏纸片琼脂扩散法检测WYZ-1、WYZ-2和WYZ-3对34种常用抗生素的药敏性,结果表明3株乳酸菌均对氨基糖类、喹诺酮类多数、复方新诺明、多念菌素B和氨曲南表现为耐药,对青霉素类多数、四环素类、大环内脂类及克林霉素和氯霉素敏感;WYZ-3对头孢类抗生素表现为敏感,WYZ-1和WYZ-2则对大部分头孢类抗生素表现为耐药.

关键词：乳酸菌斜带石斑鱼生物特性抑菌谱药敏性

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尼罗罗非鱼NITR基因的克隆鉴定与组织表达分析

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生物技术通报 2017年第5期33卷 145-152页

作者：汪志文黄瑜张海艳汤菊芬简纪常鲁义善广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

从尼罗罗非鱼脾脏组织中克隆获得新型免疫受体(NITR,Novel immune-type receptor)基因的编码区序列(Gen Bank登录号:KX989509;命名为On-NITR),该基因c DNA全长1 119 bp,ORF为1 026 bp,可编码341个氨基酸,理论分子量为37.38k D,等电点为8.28。通过NCBI BLAST比对发现罗非鱼NITR与其他已报道的物种NITR氨基酸序列相似度为27%-46%。氨基酸序列分析显示:On-NITR具有1个信号肽区域、2个胞外Ig-domain区、1个跨膜结构域,以及1个胞质尾区,该胞质尾区含有NITR典型的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和一个ITIM类似基序itim,且具有较高的保守性。荧光定量PCR分析显示,On-NITR在健康尼罗罗非鱼组织中均有表达,在肠道、皮肤、肝脏表达水平较高,在胸腺、鳃、脾脏、心脏、脑组织中的表达量较低,在头肾组织中的表达量最低。

关键词：尼罗罗非鱼 NITR蛋白基因克隆组织表达分析

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鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因的克隆及亚细胞定位研究

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生物技术通报 2017年第5期33卷 219-226页

作者：夏立群陈锐敏廖保山徐亮苏泽杰童邦卓广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,为兼性胞内菌。生物信息学分析显示鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因的表达产物为分泌蛋白,且可能定位于宿主细胞的线粒体上。通过构建重组质粒p EGFP-DmpA和pc DNA-DmpA、鰤鱼诺卡氏... 详细信息

鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,为兼性胞内菌。生物信息学分析显示鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因的表达产物为分泌蛋白,且可能定位于宿主细胞的线粒体上。通过构建重组质粒p EGFP-DmpA和pc DNA-DmpA、鰤鱼诺卡氏菌胞外产物鉴定、亚细胞定位、过表达等方法,对鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因进行了克隆、亚细胞定位及初步功能研究。结果表明在鰤鱼诺卡氏菌胞外产物中鉴定到了DmpA蛋白,证实其为分泌蛋白。亚细胞定位研究发现DmpA-GFP融合蛋白均匀地分布在FHM细胞中,与线粒体分布不重合,说明DmpA蛋白并不定位在线粒体上。DmpA-GFP融合蛋白的表达会改变FHM细胞线粒体的分布为团块状。DmpA在细胞中的过量表达对细胞核无明显影响,表明该基因无诱导细胞凋亡的功能。通过对鰤鱼诺卡氏菌DmpA的克隆、亚细胞定位和过表达研究,为进一步研究该基因的功能和深入了解鰤鱼诺卡氏菌的致病机理奠定了基础。

关键词：鰤鱼诺卡氏菌 DmpA基因分泌蛋白亚细胞定位

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鲍消化道及其养殖水体异养菌的耐药性研究

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南方水产科学 2017年第3期13卷 58-65页

作者：孙永婵王瑞旋赵曼曼曹超鲁义善姚托王江勇广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 中国水产科学研究院南海水产研究所广东省渔业生态环境重点实验室农业部南海渔业资源开发利用重点实验室广东广州510300

采用纸片扩散法对分离自福建省皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)消化道及其养殖水体中的284株异养细菌(其中消化道菌131株,水体菌153株)进行药物敏感测试,以期了解其耐药性概况。结果显示,皱纹盘鲍消化道与养殖水体异养菌对多种抗菌药... 详细信息

采用纸片扩散法对分离自福建省皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)消化道及其养殖水体中的284株异养细菌(其中消化道菌131株,水体菌153株)进行药物敏感测试,以期了解其耐药性概况。结果显示,皱纹盘鲍消化道与养殖水体异养菌对多种抗菌药物的耐药率差异不明显,大部分菌株对青霉素、卡那霉素、庆大霉素、利福平产生耐药性,耐药率最高达83.95%,而对诺氟沙星、恩诺沙星、氯霉素耐药率较低,受试的水体异养菌对诺氟沙星耐药率为0;不同来源菌株的多重耐药(multiple antibiotic resistance,MAR)现象普遍,消化道及其养殖水体异养菌的多重耐药率均值分别为59.15%和51.31%。该研究同时发现相同分离源的菌株对青霉素、卡那霉素、庆大霉素和利福平的耐药率呈现一定的季节波动规律,消化道异养菌于9月耐药率最低,而水体异养菌耐药率在6月最低。结果表明,皱纹盘鲍消化道及水体异养菌的多重耐药率较高,耐药状况较严重。

关键词：皱纹盘鲍异养细菌抗菌药物耐药率多重耐药性

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尼罗罗非鱼非特异性细胞毒性细胞(NCC)分离条件的优化

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广东海洋大学学报 2017年第3期37卷 123-126页

作者：郑琦陈一锦黄瑜蔡佳汤菊芬鲁义善吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088

破碎尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)头肾组织,用RPMI-1640培养基制成细胞悬液,添加至两层不同浓度的Percoll分离液液面,离心,得非特异性细胞毒性细胞(Non-specific cytotoxic cell,NCC),优化下层Percoll浓度、离心力、离心时间。结... 详细信息

破碎尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)头肾组织,用RPMI-1640培养基制成细胞悬液,添加至两层不同浓度的Percoll分离液液面,离心,得非特异性细胞毒性细胞(Non-specific cytotoxic cell,NCC),优化下层Percoll浓度、离心力、离心时间。结果表明,当下层Percoll体积分数为43%,上层Percoll体积分数为34%,离心力为500 g,离心时间为30 min时,尼罗罗非鱼NCC得率最高,为71.28%。

关键词：尼罗罗非鱼非特异性细胞毒性细胞 Percoll分离液

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