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尼罗罗非鱼Galectin-related protein B基因的原核表达与条件优化

安徽农学通报 2020年第18期26卷 12-15页

作者：黄永雄牛金中杨世平简纪常广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088

Galectin-related protein B是一种缺乏半乳糖苷结合活性的半乳糖凝集素相关蛋白B。基于NCBI公布的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)Galectin-related protein B基因序列设计带酶切位点引物,构建原核表达载体pET-28a-GRPB,将重组质粒导入大肠杆菌,诱导重组质粒的蛋白表达,并对蛋白表达条件进行优化。结果表明:在28℃条件下,IPTG浓度为0.20mmol/L,诱导6h时,诱导重组蛋白的效果最佳;经Western-blot免疫印迹显示,纯化后的重组蛋白能与带HIS标签的单抗特异结合,条带单一,进一步证明该重组蛋白为Galec⁃tin-related protein B蛋白。

关键词：尼罗罗非鱼凝集素相关蛋白B 原核表达条件优化

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湛江卵形鲳鲹致病链球菌的分离、鉴定及药敏实验

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基因组学与应用生物学 2019年第12期38卷 5403-5411页

作者：武沛文宋大伟郭丹玲庞欢瑛汤菊芬简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

为了确定2017年6月至2017年9月湛江市太平镇网箱养殖卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)疑似发生鱼链球菌病的病原菌及其毒力特性,取病鱼的脑、肝脏、脾脏和肾脏在血平板上进行分离培养,将分离培养的病原菌对卵形鲳鲹进行人工回归感染实验,... 详细信息

为了确定2017年6月至2017年9月湛江市太平镇网箱养殖卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)疑似发生鱼链球菌病的病原菌及其毒力特性,取病鱼的脑、肝脏、脾脏和肾脏在血平板上进行分离培养,将分离培养的病原菌对卵形鲳鲹进行人工回归感染实验,试验鱼呈现自然发病症状:游泳异常、眼球突出且浑浊、鳍条基部充血,证明分离菌为卵形鲳鲹爆发性流行病的致病菌。通过形态学观察、生化鉴定、16S rRNA序列分析,结果表明,分离的致病菌为海豚链球菌(Streptococcus iniae),暂定为中国湛江株GHZ007(GenBank:KX788919),其对卵形鲳鲹的LD50为2.42×106CFU/mL。药敏实验结果表明,分离菌株对四环素类和氨基糖苷类药物等17种试验药物敏感,对青霉素、复方新诺明等8种试验药物有耐药性。本研究将有助于为海豚链球菌病的防治提供理论基础。

关键词：卵形鲳鲹海豚链球菌 16S rRNA 药敏实验

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溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统C-环组分VscQ的原核表达及免疫原性

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安徽农学通报 2020年第18期26卷 101-105页

作者：曾福源伍艳清邱明生武沛文周诗慧王俊霖简纪常谢妙庞欢瑛广东海洋大学深圳研究院广东深圳510000 广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088

为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901菌株Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)胞质环(C-环)组分VscQ作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌vscQ序列(***862753),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscQ基因,进行序列分析。结果显示,该基因全长969bp,预计分子量35.61kDa。将vscQ基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEXvscQ。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,能在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为61.6kDa的VscQ融合蛋白。VscQ蛋白表达的最优条件为:0.4mmol/L IPTG,15℃条件下诱导12h。用纯化后的VscQ融合蛋白免疫白兔,获得高效多克隆抗体,抗体效价为1∶121500。兔抗VscQ血清能与重组VscQ蛋白发生特异性反应,表明T3SS C-环组分VscQ可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。

关键词：溶藻弧菌 VscQ Ⅲ型分泌系统原核表达免疫原性

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酶解豆粕蛋白替代鱼粉对凡纳滨对虾生长、饲料利用和消化酶的影响

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水产养殖 2020年第9期41卷 1-6页

作者：刘慧玲闫方权吴世林秦海鹏杨世平广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨水产经济动物病害控制广东省普通高等学校重点实验室广东湛江524088 广州智特奇生物科技股份有限公司广东广州510000

试验旨在研究酶解豆粕蛋白替代部分鱼粉对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长、饲料利用及消化酶的影响。选用初始体质量为(1.10±0.02)g的健康对虾,随机分成5组,饲养在0.5 m3的玻璃纤维钢桶中,分别投喂酶解豆粕蛋白(0、7.40%、1... 详细信息

试验旨在研究酶解豆粕蛋白替代部分鱼粉对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长、饲料利用及消化酶的影响。选用初始体质量为(1.10±0.02)g的健康对虾,随机分成5组,饲养在0.5 m3的玻璃纤维钢桶中,分别投喂酶解豆粕蛋白(0、7.40%、14.80%、22.20%和30.20%)替代基础配方中鱼粉(0、25%、50%、75%和100%)制成5组等氮等脂的饲料,试验时间为56 d。试验结果显示投喂25%和50%的酶解豆粕蛋白替代鱼粉的凡纳滨对虾增重率、特定生长率、饲料系数和蛋白质效率等无差异统计学意义(P>0.05),替代25%组和替代50%组凡纳滨对虾肝胰腺的蛋白酶和淀粉酶活性显著高于对照组(P<0.05)。研究结果表明,凡纳滨对虾饲料中酶解豆粕蛋白替代鱼粉的比例不宜超过50%。

关键词：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) 酶解豆粕鱼粉生长性能饲料系数消化酶

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罗湖病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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广东海洋大学学报 2019年第5期39卷 31-37页

作者：吴凤雷黄瑜黄郁葱蔡双虎简纪常汤菊芬广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨水产经济动物病害控制广东省普通高等学校重点实验室

【目的】建立一种快速、灵敏、特异的罗非鱼(Oreochromis spp)罗湖病毒定量检测方法。【方法】根据罗湖病毒节段8保守区设计一对特异性引物,建立检测罗湖病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性... 详细信息

【目的】建立一种快速、灵敏、特异的罗非鱼(Oreochromis spp)罗湖病毒定量检测方法。【方法】根据罗湖病毒节段8保守区设计一对特异性引物,建立检测罗湖病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了评价。【结果】标准曲线在2.5×10^8~2.5×10^0拷贝数之间有良好的线性关系(相关系数R2=0.999),检测限为2.5×100个拷贝。试验内及试验间变异系数分别为0.11%~0.43%与0.54%~1.13%,重复性强;对水生动物其他病毒和细菌均无扩增反应,有很好的特异性。【结论】新建立的罗湖病毒实时荧光定量PCR检测方法特异性好、灵敏度高、重复性强,可用于TiLV的早期的快速诊断、流行病学调查和防控。

关键词：罗非鱼罗湖病毒检测实时荧光定量RT-PCR 标准曲线

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尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因克隆与表达分析

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广东海洋大学学报 2019年第6期39卷 1-8页

作者：邹子鸿郑琦黄瑜汤菊芬王蓓鲁义善简纪常蔡佳广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨水产经济动物病害控制广东省普通高等学校重点实验室

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)淋巴毒素α基因(lymphotoxin alpha, LTα),分析该基因的组织分布,探讨该基因在抗菌抗病毒免疫过程中的重要作用。【方法】通过RACE技术获得尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因(On-LTα)的cDNA全长... 详细信息

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)淋巴毒素α基因(lymphotoxin alpha, LTα),分析该基因的组织分布,探讨该基因在抗菌抗病毒免疫过程中的重要作用。【方法】通过RACE技术获得尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因(On-LTα)的cDNA全长,通过生物信息学分析其序列结构特征;利用实时荧光定量PCR检测基因的组织分布特征,以及健康尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后该基因的表达变化,并进一步分离出尼罗罗非鱼非特异性毒性细胞(NCC),检测脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激后,On-LTα在NCC中的表达变化。【结果】On-LTα基因序列全长为2769 bp,包含705 bp开放阅读框(ORF),编码234个氨基酸(GenBank登录号:MK770358)。该蛋白属于跨膜蛋白,具有肿瘤坏死因子(TNF)家族保守结构域。实时荧光定量结果表明,On-LTα在健康尼罗罗非鱼11种组织中均有表达,在脾脏中的表达量最高;无乳链球菌刺激后,该基因在脾脏中的表达量显著升高;LPS与PolyI:C刺激后,On-LTα在NCC中表达量也显著上调。【结论】On-LTα参与了尼罗罗非鱼抗菌抗病毒的免疫应答过程。

关键词：尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因基因克隆基因表达非特异性细胞毒性细胞(NCC)

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哈氏弧菌(Vibrio harveyi)lexA基因的克隆与原核表达

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基因组学与应用生物学 2018年第10期37卷 4315-4321页

作者：常云胜周维高增鸿丁燏广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

LexA是调节SOS反应的阻遏蛋白,而且与细菌耐药性的形成密切相关。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SOS基因lexA,并对lexA基因进行了生物信息学分析;构建了lexA基因的原核表达载体... 详细信息

LexA是调节SOS反应的阻遏蛋白,而且与细菌耐药性的形成密切相关。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SOS基因lexA,并对lexA基因进行了生物信息学分析;构建了lexA基因的原核表达载体PGEX-lexA,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达成功,还对LexA蛋白表达的诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行了优化。结果表明,lexA基因的开放阅读框为621 bp,编码206个氨基酸,LexA蛋白理论分子量为22.68 kD;重组蛋白表达的最优条件为37℃、0.04 mmol/L IPTG诱导6 h。

关键词：哈氏弧菌 lexA 基因克隆原核表达

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哈氏弧菌(Vibrio harveyi)recA基因的克隆与原核表达

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基因组学与应用生物学 2018年第5期37卷 1947-1954页

SOS反应不仅能够促使细菌本身产生耐药性,而且与细菌耐药基因的水平转移密切相关。rec A是细菌SOS反应的重要基因,影响SOS反应的开启和关闭。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SO... 详细信息

SOS反应不仅能够促使细菌本身产生耐药性,而且与细菌耐药基因的水平转移密切相关。rec A是细菌SOS反应的重要基因,影响SOS反应的开启和关闭。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SOS基因rec A（recombinase A）,并对rec A基因进行了生物信息学分析。并构建了rec A基因的原核表达载体PGEX-rec A,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功诱导表达,对Rec A蛋白的诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行了优化。结果表明,rec A基因的开放阅读框为693 bp,编码230个氨基酸,Rec A蛋白理论分子量为25.29 k D。重组蛋白表达的优化条件为37℃、0.04 mmol/L IPTG诱导6 h。

关键词：哈氏弧菌 recA 基因克隆原核表达

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溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白HY322基因的克隆和生物信息学分析

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基因组学与应用生物学 2018年第7期37卷 2843-2849页

作者：宋大伟庞欢瑛邱明生林紫薇蔡双虎蔡佳汤菊芬简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

本研究从溶藻弧菌中成功克隆获得HY322基因的编码区序列（GenBank：KX245317.1）,该基因全长969 bp,可编码322个氨基酸,应用生物信息学的方法和工具对溶藻弧菌HY9901效应蛋白HY322的理化性质、蛋白结构、遗传进化关系和抗原特性等方面... 详细信息

本研究从溶藻弧菌中成功克隆获得HY322基因的编码区序列（GenBank：KX245317.1）,该基因全长969 bp,可编码322个氨基酸,应用生物信息学的方法和工具对溶藻弧菌HY9901效应蛋白HY322的理化性质、蛋白结构、遗传进化关系和抗原特性等方面进行预测和分析。结果表明：HY322蛋白为不稳定的亲水性蛋白,蛋白呈酸性,无跨膜区,无明显的信号肽;二级结构以α螺旋为主,进化分析显示溶藻弧菌HY9901与哈维氏弧菌（***）聚为一支,表明在进化关系上最为接近。HY322序列中包含有一个与鞭毛形成有关的Fli N功能结构域。多种参数预测了HY322可能的B细胞抗原优势表位,分别是第32~33、100~102、138~140、215~216、235~238、246~249区段。利用SWISS-MODEL软件,得到了HY322亚基三维模型。本研究从生物信息学角度验证了HY322作为弧菌共同抗原的可行性,为下一步的疫苗研发提供了理论依据。

关键词：溶藻弧菌三型分泌系统效应蛋白生物信息学分析

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溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白Va1686基因的克隆和生物信息学分析

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基因组学与应用生物学 2018年第3期37卷 1210-1217页

作者：宋大伟庞欢瑛邱明生林紫薇汤菊芬梁珊珊简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

本研究从溶藻弧菌中成功克隆获得Va1686基因的编码区序列（GenBank：KX245316），该基因全长1164bp，可编码387个氨基酸，应用生物信息学的方法和工具对溶藻弧菌HY9901III型分泌系统效应蛋白Va1686的理化性质、蛋白结构、遗传进化关系... 详细信息

本研究从溶藻弧菌中成功克隆获得Va1686基因的编码区序列（GenBank：KX245316），该基因全长1164bp，可编码387个氨基酸，应用生物信息学的方法和工具对溶藻弧菌HY9901III型分泌系统效应蛋白Va1686的理化性质、蛋白结构、遗传进化关系和抗原特性等方面进行预测和分析。结果表明：Va1686蛋白为稳定的亲水性蛋白，蛋白呈酸性，不具有跨膜区和信号肽，二级结构以仅螺旋为主。进化分析显示溶藻弧菌HY9901与哈维氏弧菌（***）聚为一支，表明在进化关系上最为接近。Va1686蛋白包含一段与细胞分裂相关的Fic superfamily保守结构域。生物信息学分析表明Va1686可能的B细胞抗原优势表位，分别是第48～49、82～85、125～126、150～153、185～186、236～237等区段。利用SWISS-MODEL软件，模拟了Va1686亚基三维结构模型，发现与其同源蛋白副溶血弧菌vopS非常相似，相似度达到89．46％。本研究从生物信息学角度分析了Va1686作为弧菌共同抗原的可行性，为下一步的疫苗研发提供了理论依据。

关键词：溶藻弧菌三型分泌系统效应蛋白生物信息学分析

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