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中国免疫学杂志 2019年第5期35卷 584-590页

作者：杨浩程龙球黄建芳朱柳蓉刘洋向军俭暨南大学抗体工程研究中心生命科学技术学院生物工程学系广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广州510632

目的:用自制重金属铜单抗和合成铜完全抗原,建立检测重金属铜离子的间接竞争化学发光酶联免疫(CLEIA)法,为植物中草药和土壤环境中铜的快速定量测定提供简便、可靠的方法。方法:使用本实验室前期制备并鉴定合格的优质铜单抗和合成铜抗原... 详细信息

目的:用自制重金属铜单抗和合成铜完全抗原,建立检测重金属铜离子的间接竞争化学发光酶联免疫(CLEIA)法,为植物中草药和土壤环境中铜的快速定量测定提供简便、可靠的方法。方法:使用本实验室前期制备并鉴定合格的优质铜单抗和合成铜抗原,建立铜间接竞争CLEIA法,并对其准确度、精密度、特异性和稳定性进行评价;采集植物中草药和土壤样品共31份,通过微波消解联合沉淀法进行前处理并制备待测样,由间接竞争CLEIA法进行铜含量测定,以ICP-AES仪器法所测结果为对照评价其可靠性。结果:该方法检测灵敏度为17. 9 ng/ml,检测限为1. 9 ng/ml,线性范围为3. 0～200 ng/ml;准确度试验回收率为98. 8%～105. 5%,精密度试验RSD≤5. 0%;特异性试验仅与Mg^(2+)、Zn^(2+)有13. 3%、3. 3%的交叉反应;酶标板置-20℃避光保存6周内其检测结果准确性未出现明显改变。对植物中草药和土壤样品进行前处理并制样检测,对比ICP-AES法检测结果,相关系数分别为0. 972和0. 989,两种方法具有较好相关性,表明间接竞争CLEIA法可应用于一般环境样品中铜的简便快速定量测定。结论:成功建立铜间接竞争CLEIA检测法,其灵敏度及各参数均符合国家法定相关样品铜离子检测技术指标的要求,可应用于一般环境样品中铜含量的快速测定。

关键词：铜离子单克隆抗体间接竞争化学发光酶联免疫

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抗人PD-L1单克隆抗体制备及其在肿瘤病理诊断中的意义

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中国免疫学杂志 2019年第6期35卷 707-710页

作者：廖伟聪黄建芳向军俭冯沛然何亚运张宇暨南大学抗体工程研究中心广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广州510632 广东医科大学基础医学院病理系湛江524023

目的:研制用于肿瘤临床诊断的高亲和力、高特异性的抗人PD-L1单克隆抗体。方法:用重组人PD-L1胞外段蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术和间接ELISA筛选,鉴定获得可稳定分泌抗人PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过SDS-PAGE、间... 详细信息

目的:研制用于肿瘤临床诊断的高亲和力、高特异性的抗人PD-L1单克隆抗体。方法:用重组人PD-L1胞外段蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术和间接ELISA筛选,鉴定获得可稳定分泌抗人PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过SDS-PAGE、间接ELISA等方法鉴定其亲和力、效价、纯度及亚型;用Western blot检测肿瘤细胞(OV2008、C13等);用免疫组化(ICH)检测膀胱癌、黑色素瘤肿瘤组织芯片病理组织的PD-L1表达水平。结果:共获得4株单克隆抗体,其中Ab3亲和力高、特异性强,其效价和亲和常数分别为4. 1 ng/ml、7. 85×10~9M^(-1),与PD-L2无交叉反应,可识别肿瘤细胞中的天然PD-L1; ICH结果表明,Ab3抗体能特异性检测出膀胱癌和黑色素瘤组织中PD-L1表达水平的高、中、低。结论:获得一株可分泌高亲和力、高特异性的抗人PD-L1单抗的杂交瘤细胞株,可用于膀胱癌和黑色素瘤组织的PD-L1表达水平的检测。

关键词：单克隆抗体 PD-L1 Western blot 免疫组化肿瘤分子诊断

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FGF2人源化单抗E12及其联合顺铂/紫杉醇体外抑制乳腺癌细胞增殖作用的研究

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中国免疫学杂志 2018年第8期34卷 1187-1194页

作者：张宇黄建芳徐萌王宏向军俭暨南大学抗体工程研究中心生命科学技术学院生物工程学系广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广州510632 暨南大学附属第一医院肿瘤科广州510630

目的:研究人源化FGF2单抗体E12体外联合化疗药物抑制乳腺癌肿瘤细胞增殖的作用。方法:分析人源化FGF2单抗可变区人源氨基酸序列比率;SDS-PAGE和HPLC检测单抗纯度;ELISA测定单抗效价;BSA法检测单抗浓度;CCK-8法检测单抗联合化疗药物对乳... 详细信息

目的:研究人源化FGF2单抗体E12体外联合化疗药物抑制乳腺癌肿瘤细胞增殖的作用。方法:分析人源化FGF2单抗可变区人源氨基酸序列比率;SDS-PAGE和HPLC检测单抗纯度;ELISA测定单抗效价;BSA法检测单抗浓度;CCK-8法检测单抗联合化疗药物对乳腺癌肿瘤细胞株的细胞增殖抑制作用;流式细胞术检测FGF2单抗联合化疗药物对乳腺癌细胞株的促凋亡作用;使用Discovery Studio 4.5软件对单抗的表位进行分析。结果:单抗可变区人源氨基酸序列比率重链为98.89%,轻链为100.00%;单抗纯度为99.02%;单抗ELISA效价为1/243 000;单抗浓度为8.74 mg/ml;CCK-8结果表明顺铂为10、5、2.5、0.625μg/ml时,单抗+顺铂组比顺铂组对MCF-7细胞抑制率提高了14.5%、10.4%、1.5%、0.5%;对MDAMB453细胞抑制率提高了15.5%、14.8%、13.0%、6.8%,紫杉醇为1.0、0.1、0.01μg/ml时,单抗+紫杉醇组比紫杉醇组对MCF-7细胞抑制率提高了14.5%、11.1%、9.3%,紫杉醇为0.1、0.01、0.001μg/ml时,单抗+紫杉醇组比紫杉醇组对MDAMB453细胞的抑制率提高了18.6%、19.9%、6.8%;流式结果表明,单抗、紫杉醇及单抗+紫杉醇组的MCF-7细胞在Annexin V/PI双阳性区所占比例提高了6.13%、7.36%和12.83%,同理MDA-MB453细胞所占比例提高了4.86%、7.1%和14.1%,单抗、顺铂及单抗+顺铂组MCF-7细胞在Annexin V/PI双阳性区所占比例提高了6.39%、9.46%和17.76%,同理MDA-MB453细胞所占比例提高了5.38%、9.06%和19.39%;表位分析结果表明FGF2单抗有效封闭FGF2与受体结合的部分位点。结论:FGF2人源单抗E12人源化程度较高;FGF2人源化单抗联合化疗药物相对单药组可较明显地提高肿瘤细胞增殖抑制作用以及促细胞凋亡作用;本研究为FGF2抗体药物研发提供了前期基础。

关键词：碱性成纤维细胞生长因子人源化单克隆抗体 E12 MCF-7 MDA-MB453 顺铂紫杉醇联合用药

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重金属铜的单抗的制备及免疫学检测方法的建立

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食品工业科技 2017年第19期38卷 245-248,255页

作者：郝代玲黄建芳杨浩冯沛然张宇王宏向军俭暨南大学抗体工程研究中心广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广东广州510632

目的:制备针对重金属铜离子的单克隆抗体,建立Cu2+的间接和直接竞争ELISA检测法,实现对Cu2+的快速定量测定。方法:利用双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA将Cu2+分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,制备免疫原和检测原;用免疫原免疫Balb/c小鼠;细胞融合... 详细信息

目的:制备针对重金属铜离子的单克隆抗体,建立Cu2+的间接和直接竞争ELISA检测法,实现对Cu2+的快速定量测定。方法:利用双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA将Cu2+分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,制备免疫原和检测原;用免疫原免疫Balb/c小鼠;细胞融合后,通过间接及间接竞争ELISA筛选稳定分泌抗重金属铜的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;制备腹水型单抗并进行鉴定;建立间接竞争ELISA和直接竞争ELISA。结果:成功筛选出4株稳定分泌抗重金属铜的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中G8制备出腹水型单抗效价为5×105倍,抗体亚型为Ig G1型,轻链类型为κ型,特异性检测结果表明该单抗对NOTA及Mn2+、Pb2+、Cd2+、Zn2+等其金属离子交叉反应率远低于2%,与Mg2+交叉反应率小于8%,表明单克隆抗体G8对重金属Cu2+具有很强的特异性,不会干扰结果的准确性;建立间接竞争ELISA的检测灵敏度为29.8 ng/m L,检测限为2.4 ng/m L,线性范围为4.5~196.7 ng/m L;直接竞争ELISA检测法的检测灵敏度为12.89 ng/m L,检测限为0.88 ng/m L,检测范围为1.72~96.58 ng/m L。结论:成功制备出抗重金属铜离子的单克隆抗体,并建立了间接竞争ELISA和直接竞争ELISA。

关键词：铜离子单克隆抗体间接竞争ELISA 直接竞争ELISA

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抗人PD-L1单克隆抗体的制备及其应用

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中国免疫学杂志 2017年第6期33卷 879-883页

作者：冯沛然黄建芳王敏珍廖伟聪郝代玲向军俭暨南大学抗体工程研究中心广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广州510632 暨南大学转化医学转化研究院国际免疫学中心广州510632

目的:获得能应用于临床诊断以及阻断PD-L1与PD-1结合的抗人PD-L1单克隆抗体。方法:采用重组表达的人PD-L1蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术获得稳定分泌抗人PD-L1单抗的阳性细胞株,ELISA方法鉴定抗体的特异性、亲和力、亚型... 详细信息

目的:获得能应用于临床诊断以及阻断PD-L1与PD-1结合的抗人PD-L1单克隆抗体。方法:采用重组表达的人PD-L1蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术获得稳定分泌抗人PD-L1单抗的阳性细胞株,ELISA方法鉴定抗体的特异性、亲和力、亚型等方面特性;免疫印迹、间接免疫荧光方法对肿瘤细胞进行检测;肿瘤杀伤实验验证抗体阻断活性。结果:共获得2株抗人PD-L1单抗,抗体效价分别为1∶2.56×10~6和1∶3×10~5,亲和力分别为1.5×10~9L/mol和2.5×10~8L/mol,均与PD-L2蛋白无交叉反应。免疫印迹、间接免疫荧光证实抗体有诊断作用。杀伤实验显示抗体有阻断作用。结论:共获得两株稳定分泌高效价、高特异性的抗人PD-L1单抗的杂交瘤细胞株,能作为诊断抗体应用于肿瘤表型检测和预后有效性的评估。抗体的阻断功能可应用于联合CIK细胞免疫治疗。

关键词： PD-L1 单克隆抗体流式细胞术 CIK细胞肿瘤诊断

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bFGF单抗联合紫杉醇抑制MCF-7及MCF-7紫杉醇耐药株(MCF-7/Taxol)增效作用的分子机制

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免疫学杂志 2016年第6期32卷 486-490,495页

作者：邵晨晨黄建芳谈思怡刘诗琴向军俭暨南大学抗体工程研究中心广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广州510632

目的研究bFGF单抗联合紫杉醇（Taxol）抑制MCF-7细胞增殖、诱导细胞凋亡的分子机制;探讨bFGF单抗联合Taxol对耐药株MCF-7/Taxol的增效作用及机制。方法 CCK-8法检测bFGF单抗联合Taxol对MCF-7及MCF-7/Taxol增殖抑制率;流式细胞术检测二... 详细信息

目的研究bFGF单抗联合紫杉醇（Taxol）抑制MCF-7细胞增殖、诱导细胞凋亡的分子机制;探讨bFGF单抗联合Taxol对耐药株MCF-7/Taxol的增效作用及机制。方法 CCK-8法检测bFGF单抗联合Taxol对MCF-7及MCF-7/Taxol增殖抑制率;流式细胞术检测二者联合对MCF-7、MCF-7/Taxol的凋亡作用;Western blot检测MCF-7及MCF-7/Taxol相关信号通路蛋白的表达变化。结果 CCK-8法检测结果显示bFGF单抗联合Taxol作用MCF-7、MCF-7/Taxol后对其增殖抑制率分别提高了13.40%~36.50%、9.56%~26.87%,联合能加强对细胞抑制作用。流式细胞术结果显示bFGF单抗联合Taxol作用MCF-7、MCF-7/Taxol后PI、FITC双阳性率分别提高了17.10%~23.20%、22.00%~22.70%,表明联合能加强对凋亡作用。Western blot结果显示MCF-7、MCF-7/Taxol中MabD9＋Taxol组能明显下调Raf-1、p-Erk、p-STAT3、Bcl-2、Caspase3,并上调p-JNK、Bax、cleavedCaspase3、cleaved PARP,其中Raf-1在MCF-7/Taxol中表达量较MCF-7明显下降。结论本研究揭示了bFGF单抗联合Taxol抑制MCF-7的如下机制：加强对Erk/MAPK通路的抑制,并加强上调p-JNK,下调p-STAT3的表达量,引起Bcl-2表达量下调,Bax表达上调,Caspase3、cleaved Caspase3、cleaved PARP表达变化引起细胞凋亡。且耐药株除具类似的抑制机制外,其Raf-1下调更加明显。

关键词：紫杉醇 bFGF单抗 MCF-7 耐药株MCF-7/Taxol

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人N端脑钠肽前体(NT-ProBNP)单抗制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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免疫学杂志 2016年第5期32卷 441-445页

作者：刘诗琴黄建芳谈思怡邵晨晨向军俭暨南大学抗体工程研究中心广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广州510632

目的获得人脑钠肽前体N端(NT-pro BNP)的高亲和力、高特异性的抗体,建立双抗体夹心ELISA法检测人血浆中NT-pro BNP。方法通过Discovery Studio4.0软件预测抗原表位,合成其表位肽偶联载体蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤细胞融合技术获得... 详细信息

目的获得人脑钠肽前体N端(NT-pro BNP)的高亲和力、高特异性的抗体,建立双抗体夹心ELISA法检测人血浆中NT-pro BNP。方法通过Discovery Studio4.0软件预测抗原表位,合成其表位肽偶联载体蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤细胞融合技术获得分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株,制备腹水型单抗。通过SDS-PAGE、ELISA等方法对获得的抗体性质进行鉴定,建立了双抗体夹心ELISA检测方法,并对120例临床血液样本中NT-pro BNP进行快速检测。结果获得6株能稳定分泌抗人NT-Pro BNP抗体的杂交瘤细胞株,其中4株单抗的腹水型效价高于1×10^(-6)。共筛选出4对能双抗夹心ELISA配对的抗体,其中Ab1与Ab5具有较高的灵敏度和较大的线性范围,其亲和力分别为1.0×10^(10)L/mol与5.9×109L/mol,检测线性范围:300~9 600 pg/ml。样本检测结果显示,自制试剂盒的阳性检出率为97.5%(78/80),阴性检出率为100%(40/40)。结论筛选获得1对高亲和力、高特异性的配对抗体,建立了双抗体夹心ELISA的检测方法,亦为新的快速免疫学检测方法的建立奠定了基础。

关键词：人N末端B型脑钠肽前体(NT-pro BNP) 单克隆抗体双抗体夹心ELISA

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凡纳滨对虾新过敏原烯醇化酶的鉴定

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中国免疫学杂志 2016年第6期32卷 808-811页

作者：谈思怡黄建芳孙一帆郭成斌向军俭(指导) 暨南大学抗体工程研究中心暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广州市疾病与食品安全免疫学快速检测重点实验室广州510632

目的:鉴定凡纳滨对虾分子量为47 kD过敏原的性质。方法:采用丙酮沉淀法提取凡纳滨对虾总蛋白,通过SDS-PAGE、11例虾过敏患者血清IgE的Western blot分析凡纳滨对虾中过敏原组份,运用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(Matrix-Assisted ... 详细信息

目的:鉴定凡纳滨对虾分子量为47 kD过敏原的性质。方法:采用丙酮沉淀法提取凡纳滨对虾总蛋白,通过SDS-PAGE、11例虾过敏患者血清IgE的Western blot分析凡纳滨对虾中过敏原组份,运用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(Matrix-Assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF-MS)鉴定凡纳滨对虾47 kD未知过敏原组分。结果:通过SDS-PAGE电泳证明所提取的凡纳滨对虾总蛋白组分完全。Western blot结果显示,凡纳滨对虾至少有14种与阳性血清反应的组分,其中,55%的虾过敏患者Ig E与分子量为47 kD的蛋白分子发生特异性反应,质谱分析结果显示47 kD蛋白为烯醇化酶。结论:烯醇化酶是凡纳滨对虾的一种新的过敏原。

关键词：凡纳滨对虾过敏原烯醇化酶质谱 Western blot

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PD-L1单抗的制备及其在抗肿瘤免疫应答中的作用

PD-L1单抗的制备及其在抗肿瘤免疫应答中的作用

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第十一届全国免疫学学术大会

作者：冯沛然黄建芳向军俭郝代玲王敏珍暨南大学抗体工程研究中心广东省分子免疫与抗体工程重点实验室

目的:制备PD-L1的m Ab并应用于肿瘤检测与抑瘤研究。方法:应用杂交瘤细胞技术制备PD-L1的m Ab并用腹水方式产生大量PD-L1 m Ab;用Western-blot方法检验制备的PD-L1 m Ab与人肿瘤细胞裂解液中的PD-L1结合、间接荧光标记方法通过流式细胞... 详细信息

目的:制备PD-L1的m Ab并应用于肿瘤检测与抑瘤研究。方法:应用杂交瘤细胞技术制备PD-L1的m Ab并用腹水方式产生大量PD-L1 m Ab;用Western-blot方法检验制备的PD-L1 m Ab与人肿瘤细胞裂解液中的PD-L1结合、间接荧光标记方法通过流式细胞仪分析制备的PD-L1 m Ab与人肿瘤细胞膜表面的PD-L1结合、肿瘤免疫组化方法鉴定PD-L1 m Ab;通过用表达PD-1的T细胞细胞对不同程度表达PD-L1蛋白的肿瘤进行杀伤,并与加入PD-L1抗体,检测其T细胞毒性、肿瘤细胞凋亡情况、细胞因子表达变化,研究PD-L1抗体是否能增强T细胞的杀伤活性。结果:共制备出4株高亲和力、高特异性的抗人PD-L1 m Ab,腹水效价2×106。Western-blot结果显示制备的抗PD-L1 m Ab能与人肿瘤细胞裂解液中PD-L1蛋白特异性结合。间接免疫荧光标记人肿瘤细胞流式分析证实制备的单克隆抗体能特异结合人肿瘤细胞的膜蛋白PD-L1。免疫组化结果显示该抗体在免疫病理组织中有高度特异性,在1mg/ml的抗体浓度中稀释50000倍后仍与病理组织有很强的反应性。结论:间接荧光标记PD-L1 m Ab与肿瘤细胞膜表面PD-L1特异性识别提示制备的抗体可应用于流式分析中表型测定的荧光抗体;PD-L1 m Ab与乳腺癌免疫病理组织的高度特异性反应将提示该抗体可应用于免疫病理组织的检测,与其他肿瘤组织芯片的反应试验正在进行;初步的细胞实验证明该抗体有一定的促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤,进一步的研究是T细胞联合PD-L1单抗的体内抑瘤效果。

关键词： PD-L1 单克隆抗体免疫检验点免疫治疗

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分子模拟计算与抗体设计

分子模拟计算与抗体设计

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中国细胞生物学学会细胞工程与转基因生物分会2016年年会

作者：张宇暨南大学抗体工程研究中心广东省分子免疫与抗体工程重点实验室

抗体药物在全球的销售额持续增加,是近年来制药工业中增长最快的领域,治疗疾病包括肿瘤、感染性疾病和自身免疫病等.未来抗体的开发可能会更多利用计算机的分子模拟辅助,这更加具有针对性,并可以大幅降低成本,提高效率.

关键词：抗体药物分子模拟生物信息计算机

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