检索结果-内蒙古大学图书馆

水产科学 2009年第2期28卷 67-70页

作者：丁燏唐晓尘简纪常吴灶和陈魁广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东海洋大学广东湛江524025 广东海洋大学水产学院广东湛江524025

从患典型烂趾病的虎纹蛙病灶组织分离到1株细菌,暂命名为WD-01,经人工感染证实该细菌为虎纹蛙烂趾病的病原菌。通过形态学、生理生化特性对其进行鉴定,并用纸片法进行药敏试验。鉴定结果表明,细菌WD-01为嗜水气单胞菌。药敏试验结果表明... 详细信息

从患典型烂趾病的虎纹蛙病灶组织分离到1株细菌,暂命名为WD-01,经人工感染证实该细菌为虎纹蛙烂趾病的病原菌。通过形态学、生理生化特性对其进行鉴定,并用纸片法进行药敏试验。鉴定结果表明,细菌WD-01为嗜水气单胞菌。药敏试验结果表明,新霉素、利福平、先锋霉素、诺氟沙星、庆大霉素、强力霉素、链霉素、卡那霉素、土霉素和金霉素等12种药物对菌株WD-01具有明显的抑制作用。

关键词：虎纹蛙嗜水气单胞菌烂趾病药敏试验

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溶藻弧菌T3SS exsD基因敲除突变株构建及其表型特征

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广东海洋大学学报 2021年第5期41卷 35-43页

作者：王俊霖招茵苏茵茵周诗慧曾福源谢妙王娜简纪常庞欢瑛广东海洋大学水产学院/广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 中国检验检疫科学研究院北京100176

【目的】构建溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)中的调控蛋白操纵子ExsD基因缺失株,研究exsD缺失株表型特征。【方法】采用overlapPCR技术构建缺失株ΔexsD,PCR检测缺失株ΔexsD的遗传稳定性... 详细信息

【目的】构建溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)中的调控蛋白操纵子ExsD基因缺失株,研究exsD缺失株表型特征。【方法】采用overlapPCR技术构建缺失株ΔexsD,PCR检测缺失株ΔexsD的遗传稳定性,比较缺失株与野生株之间的生长速度、泳动能力、胞外酶活性、药物敏感性、毒力,分别采用结晶紫和共聚焦电镜方法测定生物膜的差异变化,通过qRT-PCR方法分析exsD的缺失对T3SS效应蛋白Hop转录的影响。【结果】缺失株ΔexsD构建成功;与野生株相比,ΔexsD遗传稳定性和生长速度无显著差别,但泳动能力极显著上升(P <0.01),胞外蛋白酶活性显著上升(P <0.05),形成生物膜能力在24 h时提高(P <0.05);相比野生株,ΔexsD对米诺环素、庆大霉素、卡那霉素、多西环素、新霉素的敏感性从耐药变成中度敏感;ΔexsD缺失株的毒力显著上升,野生株对斑马鱼的半数致死剂量是缺失株的3.68倍。实时荧光定量结果显示,与HY9901野生型相比,exsD基因的缺失增加了效应蛋白Hop的转录表达。【结论】exsD基因对T3SS的致病性起负调控作用,为进一步阐明exsD基因在溶藻弧菌中的作用机理提供一定的理论基础。

关键词：溶藻弧菌 Ⅲ型分泌系统 exsD基因基因敲除缺失株表型特征

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利用酵母双杂交系统筛选与鉴定石斑鱼EcBAG3互作因子

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生物技术通报 2022年第8期38卷 77-83页

作者：蔡佳梁振宇黄瑜鲁义善施钢简纪常广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省水产经济动物病害控制重点实验室南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江)湛江524088 广西科学院广西北部湾海洋研究中心广西海洋天然产物与组合生物合成化学重点实验室南宁530007

以参与石斑鱼抗病毒免疫反应的EcBAG3蛋白为研究对象,采用酵母双杂交等技术筛选与鉴定EcBAG3的互作蛋白。首先构建了石斑鱼脾脏细胞的酵母双杂交cDNA文库,文库的容量为5.6×10^(6) CFU,插入片段的平均长度在750 bp以上,重组率为100... 详细信息

以参与石斑鱼抗病毒免疫反应的EcBAG3蛋白为研究对象,采用酵母双杂交等技术筛选与鉴定EcBAG3的互作蛋白。首先构建了石斑鱼脾脏细胞的酵母双杂交cDNA文库,文库的容量为5.6×10^(6) CFU,插入片段的平均长度在750 bp以上,重组率为100%。进一步利用此文库筛选EcBAG3的互作因子,初步得到了83个阳性克隆。对这些克隆进行测序与一对一互作验证,最终获得7个候选互作蛋白,功能预测结果显示,互作蛋白涉及免疫调控、转录调节、胁迫响应、信号转导等方面的功能,为进一步解析石斑鱼BAG3在病毒感染中的作用机制奠定了基础。

关键词：石斑鱼酵母双杂交 BAG3 互作蛋白

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罗非鱼源无乳链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与原核表达

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水产科学 2014年第3期33卷 175-180页

作者：李桂欢王蓓鲁义善汤菊芬黄郁葱吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室广东湛江524088 仲恺农业工程学院广东广州510225

为对罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910株甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因进行克隆及表达进行研究,根据GenBank上已登录的相关基因设计引物,采用PCR方法扩增该株细菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因,然后将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌B... 详细信息

为对罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910株甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因进行克隆及表达进行研究,根据GenBank上已登录的相关基因设计引物,采用PCR方法扩增该株细菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因,然后将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。结果显示,甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因有1011个碱基,编码336个氨基酸;同源基因序列比对显示,无乳链球菌ZQ0910株与无乳链球菌2603V/R的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的同源性最高;经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后,SDS-PAGE电泳显示甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白表达的最优条件为:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0.06mmol/L、温度37℃、诱导5h,蛋白表达量最大;HisTrap HP柱纯化后融合蛋白的质量浓度为560μg/mL;Western Blot验证甘油醛-3-磷酸脱氢酶的分子量为36.01ku。研究结果表明,成功克隆与表达了甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因,这将为进一步研究甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫原性及亚单位疫苗提供理论依据。

关键词：无乳链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆原核表达

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溶藻弧菌HY9901外膜蛋白OmpH的基因克隆及其生物信息学分析

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生物技术通报 2013年第4期29卷 116-122页

作者：周泽军庞欢瑛丁燏简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

根据已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列设计1对特异性引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株外膜蛋白OmpH的全长基因。结果显示,该基因(GenBank登录号:JX855924)全长573 bp,共编码190个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测... 详细信息

根据已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列设计1对特异性引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株外膜蛋白OmpH的全长基因。结果显示,该基因(GenBank登录号:JX855924)全长573 bp,共编码190个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测其分子量约为21.1 kD,等电点为9.02。SignalP 4.0、TMHMM Server 2.0和SofiBerry-Psite预测结果显示,OmpH不存在信号肽与跨膜区,含有1个N-糖基化位点,6个磷酸化位点,1个内质网靶信号位点以及3个微体C末端靶信号位点。利用MAGE5.0软件,以邻位相连法构建OmpH系统进化树,结果显示,溶藻弧菌OmpH与副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)等有较近亲缘关系。采用多种参数成功预测了OmpH可能的B细胞抗原优势表位,分别是第5-10、106-110、120-125、158-163和175-180区段。利用SWISS-MODEL软件,模拟了OmpH亚基三维结构模型,且与其同源蛋白大肠杆菌(Escherichia coli)Skp蛋白有相似构型。

关键词：溶藻弧菌基因克隆 OmpH基因外膜蛋白生物信息学分析

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溶藻弧菌转运蛋白TolB的免疫原性与免疫保护性

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生物技术通报 2015年第7期31卷 143-149页

作者：庞欢瑛周泽军张燕飞李静邱明生丁燏简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

旨在研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901转运蛋白Tol B作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的全基因组序列,设计特异性引物PCR扩增tol B的基因全长序列。序列分析显示,该基因(Gen Bank登录号JQ846501)全长1 353 bp,共编码450个... 详细信息

旨在研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901转运蛋白Tol B作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的全基因组序列,设计特异性引物PCR扩增tol B的基因全长序列。序列分析显示,该基因(Gen Bank登录号JQ846501)全长1 353 bp,共编码450个氨基酸残基。BLAST分析发现,溶藻弧菌tol B基因与其他已知弧菌的tol B具有较高的同源性,序列保守,可作为共同抗原候选蛋白。用原核表达的tol B蛋白免疫SPF级小鼠,制备多克隆抗体,ELISA效价达1∶40 000。免疫印迹表明鼠抗tol B血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应。为进一步研究tol B对石斑鱼(Epinephelus awoara)的免疫保护性,用Tol B蛋白两次免疫石斑鱼,ELISA检测发现,免疫石斑鱼血清的抗体效价在第4周达到峰值(1∶2 048)。攻毒实验结果表明Tol B对石斑鱼的免疫保护率为76%。结果表明,溶藻弧菌转运蛋白Tol B具有较好的免疫原性和免疫保护性,可作为弧菌亚单位疫苗的候选抗原。

关键词：溶藻弧菌 tol B基因免疫原性免疫保护

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红笛鲷T淋巴细胞酪氨酸激酶的原核表达及多克隆抗体制备

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生物技术通报 2013年第12期29卷 113-118页

作者：黄瑜张雪利蔡佳简纪常吴灶和鲁义善樊云霞广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

为研究红笛鲷(Lutjanus sanguineus)T淋巴细胞酪氨酸激酶(Lymphocyte cell kinase,LCK)蛋白在机体中的组织分布情况,克隆出红笛鲷lck(LS-lck)基因序列,经酶切、连接等步骤,构建重组质粒pET-28a-LS-LCK,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株... 详细信息

为研究红笛鲷(Lutjanus sanguineus)T淋巴细胞酪氨酸激酶(Lymphocyte cell kinase,LCK)蛋白在机体中的组织分布情况,克隆出红笛鲷lck(LS-lck)基因序列,经酶切、连接等步骤,构建重组质粒pET-28a-LS-LCK,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株后进行IPTG诱导表达。通过表达条件的优化,重组蛋白在37℃、0.03 mmol/L IPTG条件下诱导4 h后获得最大表达量,且主要以包涵体形式存在。Western blot检测重组蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,表明为目的蛋白。利用纯化后的rLS-LCK重组蛋白免疫小鼠,获得了1∶40 000高效价的抗血清,Western blot分析显示,融合蛋白能被小鼠的阳性血清识别,说明rLS-LCK融合蛋白具有较好的免疫反应性和免疫原性。

关键词：红笛鲷 lck基因原核表达 Western blot分析抗原性分析

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哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达

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生物技术通报 2015年第6期31卷 183-188页

作者：朱帆丁燏鲁义善简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶(GR)基因,并构建其原核表达载体,以获得相应的表达蛋白。将GR和p ET-32a(+)通过Bam H I和Xho I双酶切后,体外用T4连接酶连接,构建重组质粒p ET-GR;然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半... 详细信息

经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶(GR)基因,并构建其原核表达载体,以获得相应的表达蛋白。将GR和p ET-32a(+)通过Bam H I和Xho I双酶切后,体外用T4连接酶连接,构建重组质粒p ET-GR;然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用SDS-PAGE分析表达情况和表达条件。SDS-PAGE电泳获得分子量约为68.9 k D融合蛋白条带。在*** BL21(DE3)中重组质粒p ET-GR的表达条件为28℃,0.7 mmol/L的IPTG浓度诱导4 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达。哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因在大肠杆菌中获得了高效表达。

关键词：哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆原核表达

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斜带石斑鱼IL-10基因的克隆及其原核表达

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生物技术通报 2015年第9期31卷 131-137页

作者：肖周婷黄郁葱简纪常鲁义善吴灶和广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

白介素10(Interleukin-10,IL-10)是一个重要的多效细胞因子,主要作用是介导炎症反应和调控一些免疫细胞的分化和增殖。利用同源克隆和RACE-PCR技术获得全长为1 104 bp的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IL-10基因。该基因ORF为564 bp,... 详细信息

白介素10(Interleukin-10,IL-10)是一个重要的多效细胞因子,主要作用是介导炎症反应和调控一些免疫细胞的分化和增殖。利用同源克隆和RACE-PCR技术获得全长为1 104 bp的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IL-10基因。该基因ORF为564 bp,编码187个氨基酸,预测蛋白分子量为21.7 k D,等电点为5.74。氨基酸同源性比对及进化分析结果显示,斜带石斑鱼IL-10氨基酸序列和吉富罗非鱼(***)同源性最高,达72.25%。利用双酶切及质粒重组技术构建IL-10原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导原核表达。SDS-PAGE分析显示,融合蛋白分子量为37.5 k D,与预期相符;在IPTG为0.02mmol/L,37℃诱导3 h,蛋白包涵体的表达量最大。

关键词：斜带石斑鱼(Epinephelus coioides) Interleukin-10 基因克隆重组表达

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溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣护航蛋白VscO的基因克隆及其生物信息学分析

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生物技术通报 2014年第6期30卷 155-161页

作者：庞欢瑛周泽军丁燏黄郁葱吴灶和简纪常广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088 仲恺农业工程学院广州510225

克隆了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(T3SS)分子伴侣护航蛋白(Chaperone escort protein)vscO基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,vscO基因全长462 bp,编码153个氨基酸,理论分子量约为18.43 kD,pI值为9.22。细胞定位分析显示vscO基因位于外周质,不存在信号肽,无跨膜区。vscO基因具有转录起始区-35区和-10区,以及翻译识别信号SD序列(Shine-Dalgarno sequence)。该氨基酸序列含有多种活性位点,如蛋白激酶C磷酸化位点等。系统进化树发现溶藻弧菌的VscO蛋白与副溶血弧菌聚为同一亚族。VscO亚基三维结构模型显示其与副溶血弧菌T3SS的YscO蛋白有相似构型。信号通路分析推测VscO位于T3SS的针状样结构上。蛋白网络互作图谱发现VscO与10种T3SS蛋白具有相邻关系。本研究结果将为溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统护航机制的研究奠定基础。

关键词：溶藻弧菌 Ⅲ型分泌系统(T3SS) 分子伴侣护航vscO基因

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