目的:骨质疏松是一种溶骨性疾病,机理主要表现为破骨细胞形成明显增强和骨吸收逐渐增多。当前,筛选出可抑制破骨细胞形成和功能的药物对于治疗骨质疏松症至关重要。木豆素是一种天然化合物,提取自中药木豆叶,目前已有研究证明其具有明显的抗菌、抗炎和抗癌作用,然而其在骨质疏松症中是否有预防作用尚不清楚。本文旨在探讨木豆素单体对骨质疏松症等类溶骨性疾病的防治作用及具体机制。方法:通过提取并培养12周龄C57BL/6小鼠BMM和培养RAW264.7细胞,进行MTS、破骨细胞生成TRAcP染色、Luciferase荧光素酶基因报告、PCR、Western Blot、ROS清除、钙离子震荡等体外实验;并通过建立OVX小鼠模型,观察作用后的小鼠Micro-CT形态学,股骨近端骨组织HE,TRAcP染色等组织形态学试验,探讨木豆素对于OVX小鼠的骨丢死等方面的作用效果;最后通过木豆素胶囊(主要含木豆提取物)治疗40例OP患者,随访时间0.5-1.1(0.86±0.31)年,观察治疗前后的患者骨密度的改变情况,明确该木豆素治疗OP的临床疗效。结果:木豆素可通过剂量依赖的方式抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和骨吸收;并且能够抑制破骨细胞形成过程中的破骨标志基因如CTSK,V-ATPase-d2,TRAcP,Calcitonin receptor,NFATc1和C-Fos的表达;还能够通过抑制破骨细胞分化过程中的上下游通路中蛋白质的表达水平,从而抑制RANKL诱导的NF-κB和NFAT通路的活性。另外,还可抑制RANKL诱导的活性氧(ROS)反应以及破骨细胞分化过程中重要的钙离子震荡反应。此外,通过小鼠体内卵巢切除动物模型试验,我们发现木豆素能够扭转由卵巢切除术引起的骨丢失,具体表现为microCT实验组比对照组骨量增加,TRAcP染色见破骨细胞减少,HE染色见骨量增多等表现。临床研究发现,40例患者的治疗前后的骨密度增加具有统计学意义(其中性别是影响因素)。图1.木豆素抑制RANKL诱导的破骨细胞形成(A)为木豆素的分子结构,(B)为用不同浓度的木豆素处理RANKL刺激5天后的破骨细胞的代表性图像,图像放大100倍,比例尺为100μm,(C)为用不同浓度的木豆素处理后的TRAcP染色的总体表观图。(D)为MTS试验的结果,在不同浓度的木豆素作用48小时后,细胞增殖不受影响,结果证实木豆素对破骨细胞没有毒性。(E)木豆素对成骨细胞分化的作用。(F)对成骨细胞分化过程中ALP活性的影响。图E和F通过使用茜素红钙结节形成染色的ALP活性检测发现,木豆素并不促进也不抑制骨重塑中的成骨细胞分化功能图2.木豆素抑制破骨细胞对羟基磷灰石的骨吸收和抑制破骨细胞分化过程中RANKL诱导的基因表达水平(A)为在羟磷灰石涂层表面(刻度尺=500μm)上的TRAcP染色和破骨细胞吸收后的代表性图像。(B)为TRAcP染色定量分析后破骨细胞的数量统计图。(C)为每个破骨细胞的羟基磷灰石表面吸收面积的百分比的定量分析。(D)对使用RANKL和不同浓度的木豆素刺激5天后的破骨细胞提取总的RNA,并进行实时定量PCR分析。结果显示破骨细胞标记基因CTSK,V-ATPase-d2,TRAcP,降钙素受体,NFATc1和C-Fos的表达水平明显有降低图3.木豆素抑制RANKL刺激的NF-κB活性和IκBα和ERK降解(A)用NF-κB荧光素酶报告基因构建体稳定转染的RAW264.7细胞。首先用木豆素处理1小时,然后用RANKL刺激6小时。裂解后离心的上清被收集起来用BMG Polar Star Optima发光读数器测量荧光素酶活性。(B)用木豆(10μM)预处理1小时,BMM细胞用RANKL(100ng/ml)刺激0,5,10,20,30和60分钟。提取蛋白,检测IκB-α和β-肌动蛋白表达。然后使用ImageJ统计,确定IκBα除以β-肌动蛋白条带和ERK除以ERK磷酸化的密度比值图4.木豆素抑制RANKL刺激的NFAT活性和NFATc1和V-ATPase-d2的表达(A)用NFAT荧光素酶报道构建体稳定转染的RAW264.7细胞。首先用木豆素处理1小时,然后用RANKL刺激24小时。裂解后离心的上清被收集起来用BMG Polar Star Optima发光读数器测量荧光素酶活性。(B)BMM细胞用木豆素(10μM)预处理1小时,然后用RANKL(100ng/ml)刺激0,1,3,5天。提取蛋白,检测NFATc1,V-ATPase-d2和β-肌动蛋白的表达水平。然后使用ImageJ统计,确定NFATc1除以β-肌动蛋白条带和V-ATPase-d2除以β-肌动蛋白条带的密度比值。图5.木豆素阻断RANKL诱导的Ca2+振荡图和抑制RANKL诱导的ROS清除RANKL刺激会导致Ca2+信号转
暂无评论